Álvarez San Martín, Cristina
Gil Huerta, Lydia (dir.) ; González Orti, Noelia (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2020
Resumen: Nuestros trabajos de investigación están dedicados al estudio de nuevos componentes y/o nuevas técnicas que permitan incrementar esta calidad espermática.
En la primera experiencia se evaluó la adición de calostro de yegua en diluyentes para congelación de semen de caballos para mejorar la calidad espermática. Para ello se recogieron muestras de calostro de cuatro yeguas justo tras el nacimiento del potro y se determinó su composición y su calidad. Se recogieron eyaculados de nueve sementales fértiles con buena calidad seminal y tras llevar las muestras a la Facultad y realizar otra evaluación, fueron agrupadas y criopreservadas en tres grupos experimentales: diluyentes a base de lactosa complementada con calostro de yegua (20%), diluyentes a base de lactosa complementada con yema de huevo (20%),
y BotuCrio. Después de la descongelación se hizo una contrastación para determinar la calidad de las muestras. La motilidad de los espermatozoides se evaluó mediante
sistema computerizado ISAS Proiser, la viabilidad mediante SYBR-14 y tinción con yodo de propidio (PI), la integridad del acrosoma mediante isotiocianato de fluoresceína y aglutinina de maní (FITC-PNA) y tinción de PI, la funcionalidad de la membrana plasmática mediante el test hipoosmótico (HOS) y la desnaturalización del ADN mediante tinción de naranja de acridina (AO). En cuanto a los resultados obtenidos se observó que entre los diluyentes no hubo diferencias significativas en los porcentajes de motilidad total, integridad del acrosoma y fragmentación de ADN después de la descongelación. Los parámetros cinemáticos, sin embargo, si mostraron
valores significativamente más altos en BotuCrio que en los diluyentes a base de lactosa (P <.05). Tanto BotuCrio como los diluyentes de calostro presentaron tasas significativamente mejores para la prueba de HOS, linealidad, rectitud y oscilación que el diluyente de yema de huevo (P <0,05). Sin embargo, en relación con la viabilidad de los espermatozoides, los diluyentes con yema de huevo mostraron significativamente mejores resultados en comparación con los otros medios experimentales (P <.05). En conclusión, la incorporación del calostro de yegua en medios de crioconservación protegió a los espermatozoides contra el shock térmico; por lo tanto, su utilización puede ser una buena alternativa como agente crioprotector en los diluyentes para congelar semen equino.
En la segunda experiencia enfocamos nuestro trabajo a valorar la calidad espermática del semen congelado de burros (Equus asinus) ya que, actualmente, después de ser descongelado todavía sigue dando pobres resultados, inferiores a la de otros animales, incluidos los caballos. El objetivo de este estudio fue valorar el efecto protector de la adición de calostro de burra en los diluyentes para la congelación de semen asnal. Después de descongelar evaluamos la motilidad de los espermatozoides mediante sistema informático tipo CASA, viabilidad mediante SYBR-14 y yoduro de propidio (PI), integridad funcional de la membrana mediante prueba HOS e integridad del acrosoma por isotiocianato conjugado con aglutinina de maní (FITC-PNA) y PI. Se recogió semen de cinco burros fértiles (dos eyaculados por burro en diferentes días). Las muestras de semen se agruparon, diluyeron y criopreservaron en tres grupos experimentales: BotuCrio®, diluyente de lactosa suplementado con yema de huevo (20%) y diluyente de lactosa suplementado con calostro de burra (20%). Los resultados demostraron que las muestras con calostro de burra fueron significativamente mejores en casi todos los parámetros evaluados (p <0.05) en comparación con los otros dos diluyentes después de la descongelación (BotuCrio® y diluyente a base de yema de huevo) –Motilidad total, viabilidad, test de HOS, VCL, VSL y VAP. Los valores obtenidos en la integridad del acrosoma, LIN, STR y WOB a pesar de ser más bajos, no fueron estadísticamente significativos (p> 0.05). En conclusión, el diluyente a base de calostro de yegua puede usarse con éxito para la criopreservación del semen de burro y podría mejorar eficazmente las cualidades del semen de burro después de la descongelación.
El objetivo de la tercera experiencia fue comparar el efecto protector del calostro de yegua y de burra en la preservación espermática en la especie asnal. El calostro se obtuvo de cuatro yeguas y cuatro burras justo después del nacimiento del potro. Los eyaculados fueron recogidos de cinco burros fértiles. Las muestras de semen se agruparon, diluyeron y criopreservaron en tres grupos experimentales de diluyentes: lactosa suplementada con de yema de huevo (20%) como grupo control, lactosa suplementada con calostro de burra (20%) y lactosa suplementada con calostro de yegua (20%). Después de descongelar, evaluamos la motilidad de los espermatozoides y parámetros de velocidad mediante el sistema informático ISAS Proiser®, la viabilidad mediante SYBR-14 y yoduro de propidio (PI), la funcional de membrana mediante la prueba de HOS y la integridad del acrosoma por isotiocianato conjugado con aglutinina de maní (FITC-PNA) y PI. Los resultados obtenidos en las muestras de calostro de burra adicionada a diluyentes para congelación de semen de burro, fueron significativamente superiores (p <.05) en casi todas las pruebas evaluadas - Motilidad total, Viabilidad, test de HOS, y todos los parámetros de velocidad VCL, VSL, VAP, LIN, STR y WOB -, en comparación con el calostro de yegua y el diluyente control de yema de huevo después de la descongelación. En conclusión, al comparar calostro de burras y de yeguas en diluyente de congelación de semen de burros, los resultados son significativamente mejores cuando se utiliza calostro de burra, quizás asociado este efecto protector a la distinta composición de ambos calostros.
En la cuarta experiencia se evaluó el uso de crioprotectores no permeables, lactosa y trealosa, en la vitrificación de espermatozoides procedentes tanto de origen epididimario como de eyaculado. Las muestras de semen de eyaculado se recogieron de siete sementales fértiles y las de epidídimo de diez sementales después de su sacrificio en el matadero. Tanto las muestras de eyaculado como las de epidídimo se diluyeron y vitrificaron usando INRA 96® y albúmina de suero bovino, así como trealosa o lactosa. Como control se realizó una congelación por el método convencional con muestras epididimales y de eyaculado. La vitrificación se realizó sumergiendo suspensiones de esperma directamente en N2L, formándose esferas. Después de descongelar (control) y desvitrificar, se evaluó la motilidad de los espermatozoides y parámetros de velocidad mediante análisis computerizado ISAS Proiser®, la viabilidad se evaluó utilizando SYBR-14 y yoduro de propidio (PI) y la integridad del acrosoma mediante fluoresceína utilizando isotiocianato combinado con aglutinina de maní (FITC-PNA) y PI. En las muestras de epidídimo, la desvitrificación del grupo con trealosa (EPT) y la del grupo de lactosa (EPL) tuvo espermatozoides con mejor motilidad progresiva que en la muestra control (EPC). Después de la desvitrificación la motilidad de las muestras de EPT fue superior (P <0.001) a la de EPL (50.72 ± 5.09% vs 34.21 ± 3.02% respectivamente). Tras la desvitrificación de las muestras de eyaculado, los resultados obtenidos fueron peores que los del grupo control (P <0.001). En conclusión, la vitrificación con trealosa de espermatozoides obtenidos de epidídimo de sementales, podría ser una alternativa beneficiosa para el almacenamiento a largo plazo de muestras de semen con gran valor económico. Las muestras de eyaculado vitrificadas, sin embargo, tuvieron menores tasas de motilidad y viabilidad que las muestras sometidas a congelación convencional.
Resumen (otro idioma):
En la primera experiencia se evaluó la adición de calostro de yegua en diluyentes para congelación de semen de caballos para mejorar la calidad espermática. Para ello se recogieron muestras de calostro de cuatro yeguas justo tras el nacimiento del potro y se determinó su composición y su calidad. Se recogieron eyaculados de nueve sementales fértiles con buena calidad seminal y tras llevar las muestras a la Facultad y realizar otra evaluación, fueron agrupadas y criopreservadas en tres grupos experimentales: diluyentes a base de lactosa complementada con calostro de yegua (20%), diluyentes a base de lactosa complementada con yema de huevo (20%),
y BotuCrio. Después de la descongelación se hizo una contrastación para determinar la calidad de las muestras. La motilidad de los espermatozoides se evaluó mediante
sistema computerizado ISAS Proiser, la viabilidad mediante SYBR-14 y tinción con yodo de propidio (PI), la integridad del acrosoma mediante isotiocianato de fluoresceína y aglutinina de maní (FITC-PNA) y tinción de PI, la funcionalidad de la membrana plasmática mediante el test hipoosmótico (HOS) y la desnaturalización del ADN mediante tinción de naranja de acridina (AO). En cuanto a los resultados obtenidos se observó que entre los diluyentes no hubo diferencias significativas en los porcentajes de motilidad total, integridad del acrosoma y fragmentación de ADN después de la descongelación. Los parámetros cinemáticos, sin embargo, si mostraron
valores significativamente más altos en BotuCrio que en los diluyentes a base de lactosa (P <.05). Tanto BotuCrio como los diluyentes de calostro presentaron tasas significativamente mejores para la prueba de HOS, linealidad, rectitud y oscilación que el diluyente de yema de huevo (P <0,05). Sin embargo, en relación con la viabilidad de los espermatozoides, los diluyentes con yema de huevo mostraron significativamente mejores resultados en comparación con los otros medios experimentales (P <.05). En conclusión, la incorporación del calostro de yegua en medios de crioconservación protegió a los espermatozoides contra el shock térmico; por lo tanto, su utilización puede ser una buena alternativa como agente crioprotector en los diluyentes para congelar semen equino.
En la segunda experiencia enfocamos nuestro trabajo a valorar la calidad espermática del semen congelado de burros (Equus asinus) ya que, actualmente, después de ser descongelado todavía sigue dando pobres resultados, inferiores a la de otros animales, incluidos los caballos. El objetivo de este estudio fue valorar el efecto protector de la adición de calostro de burra en los diluyentes para la congelación de semen asnal. Después de descongelar evaluamos la motilidad de los espermatozoides mediante sistema informático tipo CASA, viabilidad mediante SYBR-14 y yoduro de propidio (PI), integridad funcional de la membrana mediante prueba HOS e integridad del acrosoma por isotiocianato conjugado con aglutinina de maní (FITC-PNA) y PI. Se recogió semen de cinco burros fértiles (dos eyaculados por burro en diferentes días). Las muestras de semen se agruparon, diluyeron y criopreservaron en tres grupos experimentales: BotuCrio®, diluyente de lactosa suplementado con yema de huevo (20%) y diluyente de lactosa suplementado con calostro de burra (20%). Los resultados demostraron que las muestras con calostro de burra fueron significativamente mejores en casi todos los parámetros evaluados (p <0.05) en comparación con los otros dos diluyentes después de la descongelación (BotuCrio® y diluyente a base de yema de huevo) –Motilidad total, viabilidad, test de HOS, VCL, VSL y VAP. Los valores obtenidos en la integridad del acrosoma, LIN, STR y WOB a pesar de ser más bajos, no fueron estadísticamente significativos (p> 0.05). En conclusión, el diluyente a base de calostro de yegua puede usarse con éxito para la criopreservación del semen de burro y podría mejorar eficazmente las cualidades del semen de burro después de la descongelación.
El objetivo de la tercera experiencia fue comparar el efecto protector del calostro de yegua y de burra en la preservación espermática en la especie asnal. El calostro se obtuvo de cuatro yeguas y cuatro burras justo después del nacimiento del potro. Los eyaculados fueron recogidos de cinco burros fértiles. Las muestras de semen se agruparon, diluyeron y criopreservaron en tres grupos experimentales de diluyentes: lactosa suplementada con de yema de huevo (20%) como grupo control, lactosa suplementada con calostro de burra (20%) y lactosa suplementada con calostro de yegua (20%). Después de descongelar, evaluamos la motilidad de los espermatozoides y parámetros de velocidad mediante el sistema informático ISAS Proiser®, la viabilidad mediante SYBR-14 y yoduro de propidio (PI), la funcional de membrana mediante la prueba de HOS y la integridad del acrosoma por isotiocianato conjugado con aglutinina de maní (FITC-PNA) y PI. Los resultados obtenidos en las muestras de calostro de burra adicionada a diluyentes para congelación de semen de burro, fueron significativamente superiores (p <.05) en casi todas las pruebas evaluadas - Motilidad total, Viabilidad, test de HOS, y todos los parámetros de velocidad VCL, VSL, VAP, LIN, STR y WOB -, en comparación con el calostro de yegua y el diluyente control de yema de huevo después de la descongelación. En conclusión, al comparar calostro de burras y de yeguas en diluyente de congelación de semen de burros, los resultados son significativamente mejores cuando se utiliza calostro de burra, quizás asociado este efecto protector a la distinta composición de ambos calostros.
En la cuarta experiencia se evaluó el uso de crioprotectores no permeables, lactosa y trealosa, en la vitrificación de espermatozoides procedentes tanto de origen epididimario como de eyaculado. Las muestras de semen de eyaculado se recogieron de siete sementales fértiles y las de epidídimo de diez sementales después de su sacrificio en el matadero. Tanto las muestras de eyaculado como las de epidídimo se diluyeron y vitrificaron usando INRA 96® y albúmina de suero bovino, así como trealosa o lactosa. Como control se realizó una congelación por el método convencional con muestras epididimales y de eyaculado. La vitrificación se realizó sumergiendo suspensiones de esperma directamente en N2L, formándose esferas. Después de descongelar (control) y desvitrificar, se evaluó la motilidad de los espermatozoides y parámetros de velocidad mediante análisis computerizado ISAS Proiser®, la viabilidad se evaluó utilizando SYBR-14 y yoduro de propidio (PI) y la integridad del acrosoma mediante fluoresceína utilizando isotiocianato combinado con aglutinina de maní (FITC-PNA) y PI. En las muestras de epidídimo, la desvitrificación del grupo con trealosa (EPT) y la del grupo de lactosa (EPL) tuvo espermatozoides con mejor motilidad progresiva que en la muestra control (EPC). Después de la desvitrificación la motilidad de las muestras de EPT fue superior (P <0.001) a la de EPL (50.72 ± 5.09% vs 34.21 ± 3.02% respectivamente). Tras la desvitrificación de las muestras de eyaculado, los resultados obtenidos fueron peores que los del grupo control (P <0.001). En conclusión, la vitrificación con trealosa de espermatozoides obtenidos de epidídimo de sementales, podría ser una alternativa beneficiosa para el almacenamiento a largo plazo de muestras de semen con gran valor económico. Las muestras de eyaculado vitrificadas, sin embargo, tuvieron menores tasas de motilidad y viabilidad que las muestras sometidas a congelación convencional.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: ciencias veterinarias ; reproduccion animal ; equinos
Titulación: Programa de Doctorado en Medicina y Sanidad Animal
Plan(es): Plan 498
Nota: Presentado: 31 07 2020
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2020
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Registro creado el 2021-09-13, última modificación el 2021-09-13
