Santos De Almeida, Joana Ines
Almeida De Matos Baptista, Pedro Miguel (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2022
Resumen: Los hepatocitos diferenciados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), también conocidos como hepatocyte-like cells (HLC), proporcionan una cantidad sin precedentes de posibilidades para el desarrollo de terapias celulares y, con ello, el tratamiento de una gran variedad de enfermedades hepáticas. Sin embargo, más de quince años de investigación en este campo han sido insuficientes para obtener una terapia médica avanzada a base de HLC. Los fenotipos inmaduros que presentan estas células, la falta de protocolos fiables y reproducibles para su producción a gran escala, así como la incertidumbre con respecto a su capacidad para injertarse en andamios (o scaffolds), tanto in vitro como in vivo, son algunas de las razones que dificultan su aplicación clínica. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis ha sido el desarrollo de estrategias eficientes para generar HLC maduras y funcionales en cantidades clínicamente relevantes para su uso en terapia celular y medicina regenerativa. Para ello, se ha desarrollado un método integrado que combina plataformas de fabricación avanzada con estrategias inspiradas en procesos naturales, estudiando el efecto del microbioma intestinal humano en la maduración y la preservación de las funciones de las HLC.
Recapitular in vitro el proceso de maduración fisiológica del hígado supone un gran reto, ya que dura aproximadamente dos años desde el nacimiento e implica la inducción de una amplia gama de vías metabólicas y de desintoxicación. Investigaciones recientes sobre el desarrollo del hígado han revelado que la maduración y el desarrollo de la función hepática podrían estar altamente asociados con el establecimiento y la diversificación del microbioma intestinal.
En el Capítulo 1, discutimos las moléculas microbianas y los mecanismos moleculares que constituyen esta interacción.
En el Capítulo 2, investigamos los efectos del secretoma de la microbiota intestinal sobre la funcionalidad (o maduración) de las hPSC-HLC mediante el tratamiento de estas células, generadas utilizando diferentes estrategias en 2D o 3D, con un secretoma microbiano formulado in vitro en forma de medio condicionado. Nuestros resultados muestran que las HLC expuestas al medio condicionado presentan una mayor expresión de marcadores hepáticos (p.ej. HNF4A, CYP1B1, -3A4, -2C9, -2D6,
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-2E1, CPS1, PPARA, TLR1, -2, -5, -6, etc.); conservan la actividad basal de CYP3A4 y/o mostraban metabolismo inducible CYP3A4; mejoran la expresión de ALB; y aumentan la secreción de las proteínas hepáticas plasmáticas ALB y A1AT, en comparación con HLC no tratadas con el medio condicionado.
Dado que las terapias celulares requieren una alta producción celular, en los Capítulos 3 y 4 desarrollamos bioprocesos escalables para la producción de HLC en forma de agregados celulares tridimensionales.
En el Capítulo 3, implementamos una estrategia integrada para la producción a gran escala de hiPSC‐HLC, que combina la expansión y diferenciación en 3D de las hiPSC usando biorreactores de tanque agitado en modo de perfusión. Mediante este protocolo, las hiPSC son capaces de crecer en agregados 3D y las HLC resultantes expresan marcadores hepáticos típicos y exhiben características funcionales de los hepatocitos, incluyendo el almacenamiento de glucógeno y la capacidad de metabolización de fármacos. Además, la incorporación de un sensor de capacitancia en el sistema del biorreactor nos ha permitido demostrar por primera vez el potencial de la espectroscopia dieléctrica para monitorizar la expansión y diferenciación de hiPSC en los biorreactores de tanque agitado. Los resultados que obtuvimos mostraron una buena correlación entre la permitividad celular medida on-line y el biovolumen de los agregados medido por métodos estándar off-line.
Con el objetivo de mejorar la expansión celular y el rendimiento de la diferenciación, en el Capítulo 4 optimizamos el bioproceso al mantener la concentración de oxígeno disuelto en niveles bajos (4% O2) durante la fase de especificación hepática. Hemos validado esta optimización para dos líneas celulares de hiPSC mejorando el rendimiento de producción de HLC (hasta 3.2x106 células/mL) y la eficiencia de diferenciación (> 80% células Albumina+) en comparación con condiciones no controladas (0.6×106 células/mL). Un análisis transcriptómico detallado de las HLC en diferentes etapas de maduración muestra que las hiPSC-HLC maduras difieren aproximadamente un 35% en su transcriptoma completo con respecto a hiPSC-HCL inmaduras. Estas diferencias incluyen vías relacionadas con el injerto celular, teniendo implicaciones en la capacidad celular para injertarse en andamios, ya que solo las HLC maduras pueden adherirse, proliferar y mantener su funcionalidad después de 14 días de cultivo.
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Por último, en el Capítulo 5, presentamos una discusión general de los logros y conclusiones principales del trabajo realizado y delineamos futuras perspectivas a investigar.
En conclusión, este estudio representa un importante primer paso hacia la generación de HLC derivadas de hiPSC más maduras y funcionales que, esperamos, harán que las terapias con células madre hepáticas sean una realidad tangible para los pacientes con enfermedad hepática en etapa terminal. También abre un nuevo cambio de paradigma en la bioingeniería de células madre y lo vincula con un campo inesperado, el microbioma humano.
Resumen (otro idioma):
Recapitular in vitro el proceso de maduración fisiológica del hígado supone un gran reto, ya que dura aproximadamente dos años desde el nacimiento e implica la inducción de una amplia gama de vías metabólicas y de desintoxicación. Investigaciones recientes sobre el desarrollo del hígado han revelado que la maduración y el desarrollo de la función hepática podrían estar altamente asociados con el establecimiento y la diversificación del microbioma intestinal.
En el Capítulo 1, discutimos las moléculas microbianas y los mecanismos moleculares que constituyen esta interacción.
En el Capítulo 2, investigamos los efectos del secretoma de la microbiota intestinal sobre la funcionalidad (o maduración) de las hPSC-HLC mediante el tratamiento de estas células, generadas utilizando diferentes estrategias en 2D o 3D, con un secretoma microbiano formulado in vitro en forma de medio condicionado. Nuestros resultados muestran que las HLC expuestas al medio condicionado presentan una mayor expresión de marcadores hepáticos (p.ej. HNF4A, CYP1B1, -3A4, -2C9, -2D6,
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-2E1, CPS1, PPARA, TLR1, -2, -5, -6, etc.); conservan la actividad basal de CYP3A4 y/o mostraban metabolismo inducible CYP3A4; mejoran la expresión de ALB; y aumentan la secreción de las proteínas hepáticas plasmáticas ALB y A1AT, en comparación con HLC no tratadas con el medio condicionado.
Dado que las terapias celulares requieren una alta producción celular, en los Capítulos 3 y 4 desarrollamos bioprocesos escalables para la producción de HLC en forma de agregados celulares tridimensionales.
En el Capítulo 3, implementamos una estrategia integrada para la producción a gran escala de hiPSC‐HLC, que combina la expansión y diferenciación en 3D de las hiPSC usando biorreactores de tanque agitado en modo de perfusión. Mediante este protocolo, las hiPSC son capaces de crecer en agregados 3D y las HLC resultantes expresan marcadores hepáticos típicos y exhiben características funcionales de los hepatocitos, incluyendo el almacenamiento de glucógeno y la capacidad de metabolización de fármacos. Además, la incorporación de un sensor de capacitancia en el sistema del biorreactor nos ha permitido demostrar por primera vez el potencial de la espectroscopia dieléctrica para monitorizar la expansión y diferenciación de hiPSC en los biorreactores de tanque agitado. Los resultados que obtuvimos mostraron una buena correlación entre la permitividad celular medida on-line y el biovolumen de los agregados medido por métodos estándar off-line.
Con el objetivo de mejorar la expansión celular y el rendimiento de la diferenciación, en el Capítulo 4 optimizamos el bioproceso al mantener la concentración de oxígeno disuelto en niveles bajos (4% O2) durante la fase de especificación hepática. Hemos validado esta optimización para dos líneas celulares de hiPSC mejorando el rendimiento de producción de HLC (hasta 3.2x106 células/mL) y la eficiencia de diferenciación (> 80% células Albumina+) en comparación con condiciones no controladas (0.6×106 células/mL). Un análisis transcriptómico detallado de las HLC en diferentes etapas de maduración muestra que las hiPSC-HLC maduras difieren aproximadamente un 35% en su transcriptoma completo con respecto a hiPSC-HCL inmaduras. Estas diferencias incluyen vías relacionadas con el injerto celular, teniendo implicaciones en la capacidad celular para injertarse en andamios, ya que solo las HLC maduras pueden adherirse, proliferar y mantener su funcionalidad después de 14 días de cultivo.
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Por último, en el Capítulo 5, presentamos una discusión general de los logros y conclusiones principales del trabajo realizado y delineamos futuras perspectivas a investigar.
En conclusión, este estudio representa un importante primer paso hacia la generación de HLC derivadas de hiPSC más maduras y funcionales que, esperamos, harán que las terapias con células madre hepáticas sean una realidad tangible para los pacientes con enfermedad hepática en etapa terminal. También abre un nuevo cambio de paradigma en la bioingeniería de células madre y lo vincula con un campo inesperado, el microbioma humano.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: ingenieria sanitaria
Titulación: Programa de Doctorado en Ingeniería Biomédica
Plan(es): Plan 510
Nota: Presentado: 14 06 2022
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2022
Enlace permanente:
Registro creado el 2022-09-14, última modificación el 2022-09-14
