Ezquerra Aznárez, José Manuel
Ramón García, Santiago (dir.) ; Aínsa Claver, José Antonio (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2024
Resumen: La tuberculosis continúa siendo la primera causa de muerte entre las enfermedades infecciosas pese a disponer de tratamiento desde hace más de 70 años. Por ello, es necesario el desarrollo de nuevos fármacos que sean efectivos frente a cepas farmacorresistentes y permitan acortar la duración de los regímenes de tratamiento. El proceso de desarrollo de fármacos desde el laboratorio hasta su uso en clínica es un proceso lento y costoso. El reposicionamiento de fármacos, es decir, la búsqueda de nuevas aplicaciones para medicamentos que ya se encuentran en uso clínico, proporciona una alternativa al proceso tradicional de desarrollo de nuevos fármacos. Usando esta aproximación se descubrió que las avermectinas, una familia de compuestos que se utilizan en la actualidad como antihelmínticos, eran activas frente a Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias. En este proyecto de Tesis Doctoral se han llevado a cabo estudios para identificar el mecanismo de acción de selamectina, avermectina escogida como modelo experimental, frente a Mycolicibacterium smegmatis y M. tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG.
El modelo no patógeno M. smegmatis se utilizó para llevar a cabo ensayos de aislamiento de mutantes. La secuenciación del genoma de mutantes con un fenotipo de resistencia intermedia y la consiguiente validación genética por recombineering ingeniería genética basada en recombinación con ADN de cadena sencilla demostró que este fenotipo estaba causado por mutaciones en dos genes involucrados en el ensamblaje de la envoltura micobacteriana. Dos de los mutantes intermedios se utilizaron como genotipos de partida para aislar mutantes con resistencia de alto nivel. Sin embargo, las mutaciones responsables de este fenotipo no se pudieron identificar. En estos mutantes, la susceptibilidad a selamectina se redujo al nivel inicial en presencia de concentraciones subinhibitorias de etambutol. Asimismo, la selección de mutantes resistentes a etambutol usando uno de los mutantes con resistencia de alto nivel dio lugar a varias colonias que habían restaurado su susceptibilidad a selamectina. Estas colonias tenían mutaciones en embB que podrían reducir la actividad de la enzima EmbB, lo que sugiere que la integridad de la envoltura micobacteriana podría ser imprescindible para el desarrollo de resistencia a selamectina. Además, la ausencia de cambios en la susceptibilidad a selamectina en un mutante de deleción de embB demostró que su diana no es citosólica.
En el caso de M. tuberculosis, se utilizaron múltiples aproximaciones de biología de sistemas para estudiar el mecanismo de acción de selamectina. La secuenciación del transcriptoma de M. tuberculosis tratada con selamectina mostró que el tratamiento con selamectina indujo el regulón SigE, que se activa por estrés de superficie. A continuación, se evaluó la funcionalidad de la envoltura micobacteriana tras el tratamiento con selamectina. Los ensayos de acumulación de bromuro de etidio demostraron que selamectina no actúa como un inhibidor de eflujo clásico, si bien la acumulación de bromuro de etidio aumentó en M. smegmatis tras un pretratamiento con selamectina. El tratamiento con selamectina también redujo la fluidez de la membrana plasmática en varias especies de micobacterias, mostrando una correlación entre la concentración mínima inhibitoria y el efecto sobre la fluidez de la membrana. Los niveles de ATP también se vieron aumentados tras la exposición de M. bovis BCG a selamectina, un fenotipo que se ha descrito para múltiples inhibidores de la pared celular. En el caso particular de selamectina, este fenotipo podría estar causado por la inhibición de la síntesis de peptidoglicano.
Los ensayos de microscopía usando la plataforma ODELAM mostraron que selamectina detiene la división celular de M. bovis BCG. En consonancia con estos resultados, el uso de la plataforma TRIP mostró que la inducción de factores de transcripción que interrumpen la división celular protege a M. tuberculosis del efecto de selamectina.
Por último, selamectina mostró interacciones favorables in vitro frente a M. tuberculosis con inhibidores de la síntesis de peptidoglicano y arabinogalactano, y con compuestos que inhiben el metabolismo energético. La combinación de selamectina con los inhibidores de la síntesis de arabinogalactano etambutol y BTZ043 se estudió por medio de secuenciación de ARN. Los transcriptomas de las distintas combinaciones sugieren que el efecto bactericida se debe a la actividad de selamectina, mientras que etambutol y BTZ043 actuarían como potenciadores de esta actividad.
En conjunto, los resultados sugieren un mecanismo de acción dual de selamectina frente a micobacterias: (i) inhibición de los procesos que tienen lugar en la membrana plasmática debido a la reducción de fluidez de membrana, y (ii) inhibición de la síntesis de peptidoglicano.
Resumen (otro idioma):
El modelo no patógeno M. smegmatis se utilizó para llevar a cabo ensayos de aislamiento de mutantes. La secuenciación del genoma de mutantes con un fenotipo de resistencia intermedia y la consiguiente validación genética por recombineering ingeniería genética basada en recombinación con ADN de cadena sencilla demostró que este fenotipo estaba causado por mutaciones en dos genes involucrados en el ensamblaje de la envoltura micobacteriana. Dos de los mutantes intermedios se utilizaron como genotipos de partida para aislar mutantes con resistencia de alto nivel. Sin embargo, las mutaciones responsables de este fenotipo no se pudieron identificar. En estos mutantes, la susceptibilidad a selamectina se redujo al nivel inicial en presencia de concentraciones subinhibitorias de etambutol. Asimismo, la selección de mutantes resistentes a etambutol usando uno de los mutantes con resistencia de alto nivel dio lugar a varias colonias que habían restaurado su susceptibilidad a selamectina. Estas colonias tenían mutaciones en embB que podrían reducir la actividad de la enzima EmbB, lo que sugiere que la integridad de la envoltura micobacteriana podría ser imprescindible para el desarrollo de resistencia a selamectina. Además, la ausencia de cambios en la susceptibilidad a selamectina en un mutante de deleción de embB demostró que su diana no es citosólica.
En el caso de M. tuberculosis, se utilizaron múltiples aproximaciones de biología de sistemas para estudiar el mecanismo de acción de selamectina. La secuenciación del transcriptoma de M. tuberculosis tratada con selamectina mostró que el tratamiento con selamectina indujo el regulón SigE, que se activa por estrés de superficie. A continuación, se evaluó la funcionalidad de la envoltura micobacteriana tras el tratamiento con selamectina. Los ensayos de acumulación de bromuro de etidio demostraron que selamectina no actúa como un inhibidor de eflujo clásico, si bien la acumulación de bromuro de etidio aumentó en M. smegmatis tras un pretratamiento con selamectina. El tratamiento con selamectina también redujo la fluidez de la membrana plasmática en varias especies de micobacterias, mostrando una correlación entre la concentración mínima inhibitoria y el efecto sobre la fluidez de la membrana. Los niveles de ATP también se vieron aumentados tras la exposición de M. bovis BCG a selamectina, un fenotipo que se ha descrito para múltiples inhibidores de la pared celular. En el caso particular de selamectina, este fenotipo podría estar causado por la inhibición de la síntesis de peptidoglicano.
Los ensayos de microscopía usando la plataforma ODELAM mostraron que selamectina detiene la división celular de M. bovis BCG. En consonancia con estos resultados, el uso de la plataforma TRIP mostró que la inducción de factores de transcripción que interrumpen la división celular protege a M. tuberculosis del efecto de selamectina.
Por último, selamectina mostró interacciones favorables in vitro frente a M. tuberculosis con inhibidores de la síntesis de peptidoglicano y arabinogalactano, y con compuestos que inhiben el metabolismo energético. La combinación de selamectina con los inhibidores de la síntesis de arabinogalactano etambutol y BTZ043 se estudió por medio de secuenciación de ARN. Los transcriptomas de las distintas combinaciones sugieren que el efecto bactericida se debe a la actividad de selamectina, mientras que etambutol y BTZ043 actuarían como potenciadores de esta actividad.
En conjunto, los resultados sugieren un mecanismo de acción dual de selamectina frente a micobacterias: (i) inhibición de los procesos que tienen lugar en la membrana plasmática debido a la reducción de fluidez de membrana, y (ii) inhibición de la síntesis de peptidoglicano.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: microbiología ; antibióticos ; biología molecular de microorganismos ; enfermedades pulmonares
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 08 03 2024
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2024
Aportación del TFG/M a la Sostenibilidad: Garantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades. Reducir las desigualdades entre países y dentro de ellos.
Fecha de embargo : 2026-03-08
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Registro creado el 2024-06-13, última modificación el 2024-06-13
