Bruñén Fau, Patricia
Sancho Sanz, Javier (dir.) ; Gálvez Lafuente, José Antonio (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2026
Resumen: Las enzimas son catalizadores biológicos esenciales que aceleran reacciones fundamentales en la célula. Las flavoenzimas poseen gran relevancia biotecnológica al participar en reacciones redox mediadas por cofactores flavínicos (FMN o FAD). Generalmente, estos cofactores se unen de manera no covalente a la proteína y, aunque sus complejos presentan altas constantes de unión, su estabilidad puede verse afectada por condiciones ambientales que provoquen la disociación del cofactor con pérdida de la actividad catalítica. Esta limitación compromete la eficiencia de las flavoproteínas e incrementa los costes de su aplicación industrial.
Para superar este inconveniente, este trabajo propone desarrollar flavoproteínas modificadas en las que el cofactor flavínico se una covalentemente, aumentando la estabilidad estructural y funcional de la proteína. Como modelo se empleó la flavodoxina de Anabaena PCC 7119, cuya estructura está bien caracterizada y se obtiene fácilmente en sus formas holo y apo. Mediante mutagénesis dirigida se diseñaron mutantes que sustituyen la única cisteína nativa por alanina e incorporan residuos de cisteína en posiciones estratégicas cercanas al sitio de unión natural del FMN. Los mutantes elegidos (Thr11Cys-Cys55Ala, Thr13Cys-Cys55Ala y Thr16Cys-Cys55Ala) se expresaron en E. coli, se purificaron con buenos rendimientos y mostraron un plegamiento nativo por espectroscopía UV-VIS y dicroísmo circular.
Asimismo, se sintetizaron derivados de FMN que mantienen el anillo de isoaloxacina, indispensable para sus propiedades redox, e incorporan grupos electrófilos capaces de reaccionar covalentemente con las cisteínas introducidas. Se obtuvieron cuatro compuestos que incorporan el grupo maleimida (13, 3, 4 y 5) y uno que incorpora el grupo vinilfosfonato (2). Sus propiedades ópticas son similares a las del FMN.
Los ensayos de bioconjugación se realizaron empleando las formas apo de los mutantes, estableciéndose condiciones óptimas (10 equivalentes de compuesto, 4 horas, 25 o C, tampón TRIS-HCl 50 mM pH 8,3) que permitieron lograr enlaces covalentes estables con todos los derivados, salvo con el compuesto 2. La conjugación se confirmó mediante UV-VIS, fluorescencia y dicroísmo circular. Los bioconjugados más prometedores fueron los de Thr11Cys-Cys55Ala con los compuestos 3, 4 y 5 y los de Thr16Cys-Cys55Ala con el compuesto 5. Ensayos de diálisis demostraron que, mientras la flavodoxina silvestre y los mutantes con FMN no covalente unido liberaban progresivamente el cofactor, los bioconjugados covalentes lo mantenían unido incluso en condiciones desnaturalizantes, evidenciando la eficacia de la unión. Experimentos de desnaturalización térmica mostraron que los bioconjugados de Thr11Cys-Cys55Ala con los compuestos 3 y 4 presentaban además mayor entalpía o mayor temperatura de desnaturalización. Por otro lado, ensayos de desnaturalización reversible confirmaron que Thr11Cys-Cys55Ala y Thr16Cys-Cys55Ala con el compuesto 5 recuperaban su estructura nativa tras su desnaturalización térmica, lo que refuerza su potencial industrial.
En conclusión, este trabajo demuestra que la bioconjugación entre mutantes de flavodoxina de Anabaena y nuevos derivados de FMN permite obtener flavoproteínas con cofactores unidos covalentemente, más estables frente a condiciones adversas. Aunque quedan aspectos pendientes, como evaluar la actividad catalítica de los bioconjugados y su caracterización por rayos X, estos resultados sientan una base sólida para el diseño de flavoproteínas más robustas, aplicables en biocatálisis y biotecnología industrial.
Resumen (otro idioma):
Para superar este inconveniente, este trabajo propone desarrollar flavoproteínas modificadas en las que el cofactor flavínico se una covalentemente, aumentando la estabilidad estructural y funcional de la proteína. Como modelo se empleó la flavodoxina de Anabaena PCC 7119, cuya estructura está bien caracterizada y se obtiene fácilmente en sus formas holo y apo. Mediante mutagénesis dirigida se diseñaron mutantes que sustituyen la única cisteína nativa por alanina e incorporan residuos de cisteína en posiciones estratégicas cercanas al sitio de unión natural del FMN. Los mutantes elegidos (Thr11Cys-Cys55Ala, Thr13Cys-Cys55Ala y Thr16Cys-Cys55Ala) se expresaron en E. coli, se purificaron con buenos rendimientos y mostraron un plegamiento nativo por espectroscopía UV-VIS y dicroísmo circular.
Asimismo, se sintetizaron derivados de FMN que mantienen el anillo de isoaloxacina, indispensable para sus propiedades redox, e incorporan grupos electrófilos capaces de reaccionar covalentemente con las cisteínas introducidas. Se obtuvieron cuatro compuestos que incorporan el grupo maleimida (13, 3, 4 y 5) y uno que incorpora el grupo vinilfosfonato (2). Sus propiedades ópticas son similares a las del FMN.
Los ensayos de bioconjugación se realizaron empleando las formas apo de los mutantes, estableciéndose condiciones óptimas (10 equivalentes de compuesto, 4 horas, 25 o C, tampón TRIS-HCl 50 mM pH 8,3) que permitieron lograr enlaces covalentes estables con todos los derivados, salvo con el compuesto 2. La conjugación se confirmó mediante UV-VIS, fluorescencia y dicroísmo circular. Los bioconjugados más prometedores fueron los de Thr11Cys-Cys55Ala con los compuestos 3, 4 y 5 y los de Thr16Cys-Cys55Ala con el compuesto 5. Ensayos de diálisis demostraron que, mientras la flavodoxina silvestre y los mutantes con FMN no covalente unido liberaban progresivamente el cofactor, los bioconjugados covalentes lo mantenían unido incluso en condiciones desnaturalizantes, evidenciando la eficacia de la unión. Experimentos de desnaturalización térmica mostraron que los bioconjugados de Thr11Cys-Cys55Ala con los compuestos 3 y 4 presentaban además mayor entalpía o mayor temperatura de desnaturalización. Por otro lado, ensayos de desnaturalización reversible confirmaron que Thr11Cys-Cys55Ala y Thr16Cys-Cys55Ala con el compuesto 5 recuperaban su estructura nativa tras su desnaturalización térmica, lo que refuerza su potencial industrial.
En conclusión, este trabajo demuestra que la bioconjugación entre mutantes de flavodoxina de Anabaena y nuevos derivados de FMN permite obtener flavoproteínas con cofactores unidos covalentemente, más estables frente a condiciones adversas. Aunque quedan aspectos pendientes, como evaluar la actividad catalítica de los bioconjugados y su caracterización por rayos X, estos resultados sientan una base sólida para el diseño de flavoproteínas más robustas, aplicables en biocatálisis y biotecnología industrial.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: flavoenzimas ; ingeniería de proteínas ; cofactor covalente ; flavodoxina ; bioconjugación ; mutagénesis dirigida ; estabilidad enzimática
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 21 01 2026
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2026
Aportación del TFG/M a la Sostenibilidad: Fomentar el crecimiento económico sostenido, inclusivo y sostenible, el empleo pleno y productivo, y el trabajo decente para todos. Desarrollar infraestructuras resilientes, promover la industrialización inclusiva y sostenible, y fomentar la innovación. Garantizar las pautas de consumo y de producción sostenibles.
Fecha de embargo : 2028-01-21
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