Martínez Soriano, Blanca
Güemes Sánchez, Antonio Tomás (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2017
Abstract: JUSTIFICACIÓN DEL TEMA
El desarrollo de modelos experimentales de esteatosis ha supuesto un gran avance en el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y en el ensayo de nuevos medicamentos para revertirla. Entre estos fármacos se encuentra la melatonina, dado que actúa sobre los mecanismos de la peroxidación lipídica.
Existen hoy en día pocos modelos de esteatosis en grandes animales. Nuestro grupo de investigación ha diseñado y utilizado un modelo de esteatosis en grandes animales (cerdos Landrace) que semeja los fenómenos moleculares y celulares de la esteatosis, siendo capaz de provocar grados de infiltración grasa hepática no conseguidos por otros modelos.
OBJETIVOS
-Estudiar el efecto de la melatonina como tratamiento para la reversión de la esteatosis hepática establecida e inducida mediante una dieta especial en un modelo animal porcino, a nivel histológico, bioquímico y molecular.
-Producir un modelo de esteatosis en el cerdo por mediode alteraciones en la dieta evitando la toxicidad celular directa.
-Estudiar el efecto de la dieta sobre la reversión de la esteatosis inducida en un modelo animal porcino.
-Comparar el método de análisis histológico convencional de detección de esteatosis hepática con el método de análisis digital de las imágenes.
INTRODUCCIÓN
Podemos definir la esteatosis hepática como una enfermedad del hígado caracterizada por acumulación de ácidos grasos, colesterol y TG en el citoplasma de las células hepáticas. Se trata de una enfermedad multifactorial, y supone una condición patológica en el ser humano.
La esteatosis hepática no alcohólica desde el punto de vista histológico, es una enfermedad en la que se producen un espectro de lesiones en el tejido hepático que va desde el simple depósito de lípidos en el citoplasma de los hepatocitos hasta la inflamación, la fibrosis y la cirrosis hepática.
Ocurre en la mayoría de los casos en el contexto del paciente obeso o con síndrome metabólico, hablamos entonces de esteatosis hepática no alcohólica primaria. La esteatosis hepática no alcohólica secundaria obedece a causas metabólicas congénitas o adquiridas, causas nutricionales, procedimientos quirúrgicos, fármacos y otros tóxicos.
El síndrome metabólico comprende una serie de alteraciones entre las que destacan:
-Obesidad central.
-Resistencia insulínica: intolerancia a hidratos de carbono o bien DM tipo 2.
-Dislipemia: con aumento de la cifra de TG en suero > 150 mg/dl , disminución de las lipoproteínas de alta densidad con cifras < 40 mg/dl en hombre y < 50 mg/dl en mujeres.
-HTA: con cifras > 140/ 90.
Por lo tanto la esteatosis hepática no alcohólica se considera la manifestación hepática del síndrome metabólico.
La mayoría de estudios sobre esteatohepatitis se refieren a la teoría desarrollada por Day en 1998 como mecanismo fisiopatogénico de la esteatohepatitis hepática. Esta teoría se basa en dos impactos, dos etapas o dos “hits”.
Durante el primer “hit” suceden una serie de acontecimientos intracelulares que conducen a la acumulación de grasa en el hepatocito, situación que lo vuelve más vulnerable a la aparición del segundo “hit” o daño hepático mediado por agentes proinflamatorios como las citoquinas que conducen al estrés oxidativo y al daño mitocondrial, por el que tiene lugar la progresión de la enfermedad hacia esteatohepatitis y/o fibrosis.
Los AGL surgen en el hígado de tres fuentes distintas: lipólisis del tejido adiposo, de las fuentes dietéticas y de la síntesis de novo o lipogénesis. A su vez, los AGL pueden sufrir beta-oxidación, o pueden ser utilizados para reesterificación de TG, que a su vez pueden ser almacenados en forma de gotitas de lípidos o exportados como lipoproteína de muy baja densidad o VLDL.
La acumulación de grasa en el hígado puede ser el resultado del incremento de la síntesis de grasa, del aumento de la llegada de grasa, de la disminución de la exportación de grasa o de la disminución de la oxidación de grasa. Si la captqación y la síntesis supera la beta-oxidación y la exportación, nos encontramos ante una situación de desequilibrio y por tanto a la acumulación de grasa en el hígado o primer hit.
En esta primera etapa de la acumulación de lípidos en el hepatocito tiene especial importancia el papel de la resistencia insulínica, ya que la hiperinsulinemia produce un :
-Aumento de la lipolisis periférica.
-Aumento de la lipogénesis en el hígado (conversión de los AGL de la circulación general en TG mediante beta-oxidación o a través de un proceso de reesterifiación).
-Promueve la glucogénesis.
Tras un primer impacto, el hepatocito esteatósico se vuelve más sensible a la acción de una serie de mediadores inflamatorios (citoquinas y adipoquinas), a la disfunción mitocondrial y al estrés oxidativo, que a su vez conducen a la estatohepatitis o fibrosis, situación irreversible.
La prevalencia de NAFLD no es bien conocida y probablemente está infravalorada debido a que una gran parte de los pacientes permanecen asintomáticos o presentan alteraciones biológicas discretas (suele ser asintomática hasta que la mayor parte de las células hepáticas son afectadas).
Sin embargo sabemos que la esteatosis es una de las enfermedades hepáticas más prevalentes en el mundo occidental y la principal causa de hepatopatía crónica en la población general.
La prevalencia de la esteatosis hepática no alcohólica varía ampliamente en dependencia de la población estudiada y de la definición usada.
La prevalencia de esteatosis no alcohólica fue de entre el 20 y el 50% en dos estudios diferentes en los que se examinaron muestras histologicas de potenciales donantes vivos del hígado. En otros estudios en el que se fijó la prevalencia de esteatosis en función de criterios ultrasonográficos reportó una prevalencia de esteatosis entre 17 y 46%.
En pacientes con obesidad severa sometidos a cirugía bariátrica, la prevalencia de NAFLD puede superar el 90% y hasta el 5% pueden tener cirrosis.
En la actualidad, la prueba de oro para el diagnóstico de la esteatosis hepática es el análisis histológico mediante biopsia hepática.
Sin embargo, su uso está sujeto a ciertas controversias debido a sus limitaciones:
-Presenta tasas de morbilidad de hasta el 1% (sangrado, dolor, perforación de órganos) y de mortalidad de hasta 0,01%.
-La biopsia percutanea estudia una pequeña muestra que puede resultar poco representativa
-Además requiere de la disponibilidad de un experto en patología y unas condiciones mínimas de laboratorio de anatomía patológica, que en el caso de la extracción de hígado en el trasplante encarece el gasto del procedimiento.
La AASLD (American Assotiation of study of liver disease) restringe la biopsia hepática a casos en los que existe alta sospecha clínica de fibrosis o para diagnóstico diferencial con otras enfermedades.
El objetivo del tratamiento de la esteatosis hepática consiste en mejorar la infiltración grasa del hígado y prevenir la fibrosis. El pilar del tratamiento de la esteatosis hepática consiste en realizar cambios en el estilo de vida encaminados a la pérdida de peso, mediante dieta y ejercicio físico. Se ha demostrado que la pérdida de peso de 5-10% mejora la resistencia insulínica, los niveles de enzimas hepáticos y el daño histológico hepático. Las intervenciones farmacológicas para los pacientes con esteatosis se basan en fármacos dirigidos a tratar los componentes subyacentes del síndrome metabólico o bien en fármacos que traten la patogénesis subyacente (estrés oxidativo).
HIPÓTESIS
•La melatonina es un tratamiento efectivo para revertir la esteatosis hepática establecida e inducida mediante una dieta especial en un modelo animal porcino.
•El modelo de esteatosis basado en alteraciones en la dieta evitando la toxicidad celular directa, desarrollado por nuestro equipo de investigación, es un modelo efectivo y reproductible para inducir un alto grado de esteatosis hepática en pocas semanas.
•La melatonina es un tratamiento eficaz para mejorar los parámetros serológicos de función hepática en la esteatosis inducida mediante dieta especial en un modelo animal porcino.
•La melatonina es un tratamiento eficaz para mejorar los parámetros de estrés oxidativo producidos en la esteatosis hepática inducida mediante dieta especial en un modelo animal porcino.
•Modificaciones en la dieta habitual encaminadas a reducir la ingesta de grasas produce una mejoría en el grado de esteatosis hepática a nivel histológico, así como mejoría de los datos serológicos de función hepática y de los parámetros de estrés oxidativo.
•El análisis digital de imágenes diseñado por nuestro grupo de investigación como método de determinación del grado de esteatosis hepática es un método válido, sencillo y libre de subjetividad.
ESTUDIOS PREVIOS
Se realizó un estudio experimental previo con 6 cerdos Largue White-Landrace. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
•Se observó una mejoría del 10-20% del grado de esteatosis con regeneración de los hepatocitos centrolobulillares en 3 de las 6 muestras.
•En las otras 3 muestras, el porcentaje de esteatosis se mantiene pero no aumenta a pesar de mantener la dieta esteatósica en combinación con melatonina.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio experimental prospectivo realizado en animal de experimentación, utilizando un modelo animal porcino.
Tras tres meses de alimentación especial, fueron sometidos a un procedimiento quirúrgico con anestesia general para obtener una muestra suficiente de hígado para estudio, así como muestras de sangre.
Tras la intervención, los cerdos esteatósicos fueron asignados a 4 grupos de estudio.
Grupo 1: animales que continuaron con la dieta esteatósica durante 1 mes más y concomitantemente se les administró melatonina.
Grupo 2: animales que continuaron con la dieta esteatósica durante 1 mes más y no se les administró melatonina.
Grupo 3: animales que no continuaron con la dieta esteatósica y se les administró melatonina durante 1 mes.
Grupo 4: animales que no continuaron con la dieta esteatósica y no se les administró melatonina.
También se realizó un grupo control con 6 cerdos, que fueron animales sanos sin esteatosis, sometidos a dieta normal no esteatósica desde el inicio.
La dieta administrada fue una dieta especial para producir esteatosis hepática, basada en un alto contenido en grasa saturada, deficiente en metionina, suplementada con 2% de colesterol y 0,5% de colato sódico.
Los animales pertenecientes a los grupos de estudio 1 y 3 recibieron dosis de melatonina de 10 mg/kg/día vía oral. Se administró una única toma diaria durante un mes por medio de cápsulas que fueron ingeridas mezclada con la alimentación.
La muestra de tejido hepático se seccionó y se obtuvieron dos partes, una de ellas conservada en Formaldehido para el estudio anatomo-patológico y la otra parte fue congelada con nitrógeno líquido para el estudio de parámetros de estrés oxidativo.
La muestra sanguínea fue centrifugada para obtener suero. De esta muestra obtuvimos los parámetros de función hepática y lípidos sanguíneos.
Se estudiaron 22 variables agrupadas en 4 categorías:
-Características macroscópicas:
-Tamaño del hígado.
-Bordes del hígado
-Coloración del hígado.
-Consistencia.
-Ascitis.
-Peso del animal.
-Estudio bioquímico de muestra sanguínea:
-Triglicéridos.
-Colesterol Total.
-HDL colesterol.
-LDL colesterol
-AST.
-ALT.
-GGT.
-FA.
-G.
-Estudio bioquímico de estrés oxidativo de la biopsia hepática.
-MDA.
-Carbonilos.
-Análisis histológico de la biopsia hepática.
-Grado de esteatosis bajo visión directa del patólogo.
-Grado de esteatosis según programa informático de tratamiento de imágenes.
-Distribución de la esteatosis.
-Morfología de la esteatosis.
-Grado de fibrosis.
En nuestro estudio realizamos la Cuantificación de la esteatosis mediante análisis asistido por ordenador, con el objetivo de realizar una cuantificación objetiva disminuyendo la subjetividad interobservador.
RESULTADOS
Participaron un total de 41 animales que se recibieron en tres tandas entre 2012 y 2014. 35 animales iniciaron dieta esteatósica y 6 animales formaron parte del grupo control. De los 35 animales que iniciaron la dieta esteatósica, 4 animales murieron después de la primera biopsia por complicaciones intra o postoperatorias. Estos 4 animales se repusieron para no afectar al tamaño muestral. Por lo tanto, los 4 grupos de estudio los formaron 31 animales. Se perdieron 4 animales en el estudio.
Los 31 animales del grupo de estudio se distribuyeron de la siguiente manera en los diferentes grupos: Grupo 1: 12 animales, grupo 2: 9 animales, grupo 3: 5 animales, grupo 4: 5 animales.
La mayoría de animales alcanzaron un grado de esteaosis superior al 70% según visión directa del patólogo.
Variable peso: todos los grupos todos los grupos de estudio aumentaron su peso en la segunda biopsia o tiempo post con respecto a la primera biopsia, especialmente los grupos 3 y 4 que son los grupos que no continuaron con la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, que evalúa las variables dieta y melatonina de manera independiente sobre el porcentaje de cambio de peso, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de peso.
Variable triglicéridos: lo más destacado es que existe un descenso del valor medio en los grupos 3 y 4, que son los grupos que no han continuado con la dieta esteatósica, siendo este descenso significativo en caso del grupo 4, con un p de 0,043. En el modelo de regresión lineal, se observa que ni la dieta ni el tratamiento con melatonina ejercen una influencia en la variación de TG.
Variable colesterol total: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que han discontinuado la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de Colesterol Total.
Variable HDL: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que han discontinuado la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de HDL.
Variable LDL: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que han discontinuado la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de LDL.
Variable B: se produce un descenso del valor medio en todos los grupos, aunque este descenso de B en la segunda biopsia con respecto a la primera, sólo es significativo en el grupo 2. No observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de B, ya que no hay diferencias significativas en el porcentaje de cambio al comparar por grupos, y así se demuestra en el modelo de regresión lineal.
Variable AST: lo más destacado es que existe un descenso significativo del valor medio en los grupos 2 y 4, que son los grupos que no han tomado melatonina, con una p de 0,008 y 0,043 respectivamente. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la melatonina sobre la variación de AST.
Variable ALT: existe un AUMENTO del valor medio en los grupos 3 y 4 de manera significativa, con una p de 0,043 y 0,042 respectivamente, que son los grupos que no han continuado con la dieta esteatósica.
Variable GGT: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que no han continuado con la dieta esteatósica. No observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de GGT.
Variable FA: existe un descenso del valor medio significativo en el grupo 4, con una p de 0,043, que son los animales que no han continuado con la dieta esteatósica y no han tomado melatonina. No observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de GGT, ya que no hay diferencias significativas en el porcentaje de cambio al comparar por grupos, y así se demuestra en el modelo de regresión lineal.
Variable grado de esteatosis analizada bajo visión directa patólogo: en los grupos 3 y 4 (animales que no continuaron la dieta esteatósica), el grado de esteatosis disminuye de manera notable, mientras que en los grupos 1 y 2 el grado de esteatosis aumenta discretamente. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación del grado de esteatosis.
Variable grado de esteatosis medido por programa de análisis digital de imagen: en los grupos 3 y 4 (animales que no continuaron la dieta esteatósica), el grado de esteatosis disminuye de manera notable, al igual que ocurría según el patólogo. Sin embargo según el programa de análisis digital de imagen, el grupo 2 aumenta moderadamente el grado de esteatosis (animales que continuaron con la dieta y no tomaron melatonina), y el grupo 1 permanece prácticamente estable o incluso disminuye ligeramente. Sin embargo, al realizar el modelo de regresión lineal, sólo se confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación del grado de esteatosis.
Variable MDA: existe un descenso del valor medio en todos los grupos, sin embargo el descenso sólo es significativo para el grupo 1 (animales que han seguido con dieta esteatósica y melatonina). Este dato es interesante para nosotros. Sin embargo, no observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de MDA, ya que no hay diferencias significativas en el porcentaje de cambio al comparar por grupos, y así se demuestra en el modelo de regresión lineal.
Variable Carbonilos: existe un aumento del valor medio en todos los grupos, salvo en el grupo 1 (animales que han continuado con la dieta esteatósica y han tomado melatonina). Sin embargo sólo existe significación estadística para el descenso del grupo 4. El modelo de regresión lineal demuestra que existe una influencia tanto de la dieta como de la melatonina en la variación media de Carbonilos.
DISCUSIÓN
Como conclusiones generales de nuestro trabajo, podemos decir que no hemos podido demostrar a nivel global un efecto beneficioso de la melatonina en la mejoría o reversión de la esteatosis hepática una vez instaurada, inducida por dieta en un modelo animal porcino. No hemos conseguido demostrar el efecto hipolipemiante y citoprotector a nivel hepático de la melatonina, a diferencia de los resultados obtenidos en la literatura en estudios experimentales y en estudios clínicos en humanos. Sin embargo, aunque no hemos obtenido resultados contundentes sobre un efecto beneficioso de la melatonina, hemos encontrado diversos indicios de mejoría a nivel histológico y a nivel de los parámetros de estrés oxidativo. Hemos comprobado en nuestro estudio que, en el análisis histológico de la muestra hepática mediante programa de tratamiento de imágenes (libre de subjetividad), de los animales que continúan con la dieta, los que no consumen melatonina no aumentan de media la esteatosis tanto como los que no la consumen, de manera significativa (p=0,002). En cuanto a los parámetros de estrés oxidativo, el MDA disminuye de manera significativa en el grupo de animales que continúan con la dieta y toman melatonina, aunque no existen diferencias significativas en cuanto a porcentaje de cambio al comparar por grupos. En cuanto a Carbonilos, observamos que de los animales que continúan con la dieta esteatósica, el nivel de carbonilos desciende de manera significativa en los animales tratados con melatonina con respecto a los no tratados (p=0,014).
Si bien es cierto que estos indicios de mejoría de la melatonina a nivel histológico y a nivel de estrés oxidativo, son resultados positivos, ya que nuestro estudio es el primer trabajo realizado en un modelo de grandes animales en el que se estudia el efecto de la melatonina como tratamiento en la reversión de la esteatosis hepática instaurada. Hasta ahora todos los modelos experimentales se realizaban con roedores y la gran mayoría probando la melatonina como prevención de la esteatosis hepática. Sólo en el estudio de Hatzis encontramos similitudes con nuestro estudio, ya que en un grupo de roedores se administró dieta esteatósica durante 8 o 12 semanas y en las últimas 4 semanas se administró melatonina vía intraperitoneal. Los autores de este estudio concluyen que en este grupo de roedores no existe ningún efecto protector de la melatonina en una fase tardía, por lo tanto, es la primera vez que en la literatura se hace referencia a que la melatonina no podría ser eficaz ante la enfermedad hepática ya instaurada.
Los estudios realizados en humanos tienen el hándicap de que no realizan biopsias para corroborar la mejoría de la esteatosis hepática tras la administración de melatonina, probablemente por el porcentaje de complicaciones no desdeñable que conlleva este método diagnóstico.
Con este trabajo podemos demostrar cierto efecto protector de la melatonina en cuanto a menor progresión de la esteatosis en la muestra histológica, sin embargo no podemos demostrar la mejoría, como en otros estudios. Podemos sacar varias reflexiones al respecto.
La primera, a la cual ya se ha hecho referencia, es que en nuestro trabajo partimos de niveles de esteatosis muy elevados. Los estudios experimentales en roedores administran la melatonina de manera concomitante con la dieta rica en grasas, por lo que pretenden encontrar un efecto protector de la melatonina en la instauración de la esteatosis hepática, no la reversión de la esteatosis hepática, que es el objetivo de nuestro estudio. Por otra parte, en los estudios realizados en humanos el grado de esteatosis del que se parte no llega a los niveles tan elevados de esteatosis de los que partimos nosotros. Por lo tanto es posible que la melatonina tenga un efecto preventivo de la lesión hepática o incluso sirva como tratamiento de la esteatosis hepática cuando el grado de afectación grasa de los hepatocitos es menor, siendo difícil su reversión cuando la afectación hepatocitaria es mayoritaria y no cesa el estímulo que la produjo.
Otro aspecto a tener en cuenta es el tiempo de administración de melatonina. Hemos visto que en nuestro estudio se obtienen resultados positivos a nivel molecular, en el mecanismo íntimo de producción de NAFLD, es decir, observamos que la melatonina atenua el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica en los grupos de animales que continúan con la dieta, sin embargo los cambios a nivel histológico han sido solo de prevenir la progresión. Esto puede ser debido a que el período de administración de melatonina (1 mes) o la dosis administrada (10 mg/kg/día) es insuficiente para observar cambios en la acumulación de lípidos hepatocitarios a nivel histológico. Se necesitarían estudios con un tiempo de administración más prolongado de melatonina o con una dosis mayor para demostrar este efecto.
CONCLUSIONES
1.Nuestro modelo experimental de esteatosis en grandes animales basado en modificaciones de la dieta, es capaz de provocar cambios histológicos hepáticos similares a NAFLD con grados de infiltración grasa por encima del 40% tras 3 meses de dieta.
2.La medición del grado de infiltración grasa del hígado estimada subjetivamente por el patólogo magnifica el porcentaje de esteatosis comparado con el método de medición realizado con ayuda de un programa informático de tratamiento de imágenes.
3.La melatonina administrada vía oral en una sola toma a dosis de 10 mg/kg/día durante 4 semanas es incapaz de revertir la esteatosis hepática en un modelo de hígado graso porcino con elevados grados de infiltración grasa.
4.La melatonina administrada vía oral en una sola toma a dosis de 10 mg/kg/día durante 4 semanas es incapaz de modificar los niveles de lípidos plasmáticos ni los parámetros serológicos de daño hepático provocados por la dieta inductora de esteatosis.
5.La melatonina administrada vía oral en una sola toma a dosis de 10 mg/kg/día durante 4 semanas produce un efecto de disminución de la peroxidación lipídica medida mediante la disminución de MDA y medido mediante la disminución de los Carbonilos.
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Abstract (other lang.):
El desarrollo de modelos experimentales de esteatosis ha supuesto un gran avance en el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y en el ensayo de nuevos medicamentos para revertirla. Entre estos fármacos se encuentra la melatonina, dado que actúa sobre los mecanismos de la peroxidación lipídica.
Existen hoy en día pocos modelos de esteatosis en grandes animales. Nuestro grupo de investigación ha diseñado y utilizado un modelo de esteatosis en grandes animales (cerdos Landrace) que semeja los fenómenos moleculares y celulares de la esteatosis, siendo capaz de provocar grados de infiltración grasa hepática no conseguidos por otros modelos.
OBJETIVOS
-Estudiar el efecto de la melatonina como tratamiento para la reversión de la esteatosis hepática establecida e inducida mediante una dieta especial en un modelo animal porcino, a nivel histológico, bioquímico y molecular.
-Producir un modelo de esteatosis en el cerdo por mediode alteraciones en la dieta evitando la toxicidad celular directa.
-Estudiar el efecto de la dieta sobre la reversión de la esteatosis inducida en un modelo animal porcino.
-Comparar el método de análisis histológico convencional de detección de esteatosis hepática con el método de análisis digital de las imágenes.
INTRODUCCIÓN
Podemos definir la esteatosis hepática como una enfermedad del hígado caracterizada por acumulación de ácidos grasos, colesterol y TG en el citoplasma de las células hepáticas. Se trata de una enfermedad multifactorial, y supone una condición patológica en el ser humano.
La esteatosis hepática no alcohólica desde el punto de vista histológico, es una enfermedad en la que se producen un espectro de lesiones en el tejido hepático que va desde el simple depósito de lípidos en el citoplasma de los hepatocitos hasta la inflamación, la fibrosis y la cirrosis hepática.
Ocurre en la mayoría de los casos en el contexto del paciente obeso o con síndrome metabólico, hablamos entonces de esteatosis hepática no alcohólica primaria. La esteatosis hepática no alcohólica secundaria obedece a causas metabólicas congénitas o adquiridas, causas nutricionales, procedimientos quirúrgicos, fármacos y otros tóxicos.
El síndrome metabólico comprende una serie de alteraciones entre las que destacan:
-Obesidad central.
-Resistencia insulínica: intolerancia a hidratos de carbono o bien DM tipo 2.
-Dislipemia: con aumento de la cifra de TG en suero > 150 mg/dl , disminución de las lipoproteínas de alta densidad con cifras < 40 mg/dl en hombre y < 50 mg/dl en mujeres.
-HTA: con cifras > 140/ 90.
Por lo tanto la esteatosis hepática no alcohólica se considera la manifestación hepática del síndrome metabólico.
La mayoría de estudios sobre esteatohepatitis se refieren a la teoría desarrollada por Day en 1998 como mecanismo fisiopatogénico de la esteatohepatitis hepática. Esta teoría se basa en dos impactos, dos etapas o dos “hits”.
Durante el primer “hit” suceden una serie de acontecimientos intracelulares que conducen a la acumulación de grasa en el hepatocito, situación que lo vuelve más vulnerable a la aparición del segundo “hit” o daño hepático mediado por agentes proinflamatorios como las citoquinas que conducen al estrés oxidativo y al daño mitocondrial, por el que tiene lugar la progresión de la enfermedad hacia esteatohepatitis y/o fibrosis.
Los AGL surgen en el hígado de tres fuentes distintas: lipólisis del tejido adiposo, de las fuentes dietéticas y de la síntesis de novo o lipogénesis. A su vez, los AGL pueden sufrir beta-oxidación, o pueden ser utilizados para reesterificación de TG, que a su vez pueden ser almacenados en forma de gotitas de lípidos o exportados como lipoproteína de muy baja densidad o VLDL.
La acumulación de grasa en el hígado puede ser el resultado del incremento de la síntesis de grasa, del aumento de la llegada de grasa, de la disminución de la exportación de grasa o de la disminución de la oxidación de grasa. Si la captqación y la síntesis supera la beta-oxidación y la exportación, nos encontramos ante una situación de desequilibrio y por tanto a la acumulación de grasa en el hígado o primer hit.
En esta primera etapa de la acumulación de lípidos en el hepatocito tiene especial importancia el papel de la resistencia insulínica, ya que la hiperinsulinemia produce un :
-Aumento de la lipolisis periférica.
-Aumento de la lipogénesis en el hígado (conversión de los AGL de la circulación general en TG mediante beta-oxidación o a través de un proceso de reesterifiación).
-Promueve la glucogénesis.
Tras un primer impacto, el hepatocito esteatósico se vuelve más sensible a la acción de una serie de mediadores inflamatorios (citoquinas y adipoquinas), a la disfunción mitocondrial y al estrés oxidativo, que a su vez conducen a la estatohepatitis o fibrosis, situación irreversible.
La prevalencia de NAFLD no es bien conocida y probablemente está infravalorada debido a que una gran parte de los pacientes permanecen asintomáticos o presentan alteraciones biológicas discretas (suele ser asintomática hasta que la mayor parte de las células hepáticas son afectadas).
Sin embargo sabemos que la esteatosis es una de las enfermedades hepáticas más prevalentes en el mundo occidental y la principal causa de hepatopatía crónica en la población general.
La prevalencia de la esteatosis hepática no alcohólica varía ampliamente en dependencia de la población estudiada y de la definición usada.
La prevalencia de esteatosis no alcohólica fue de entre el 20 y el 50% en dos estudios diferentes en los que se examinaron muestras histologicas de potenciales donantes vivos del hígado. En otros estudios en el que se fijó la prevalencia de esteatosis en función de criterios ultrasonográficos reportó una prevalencia de esteatosis entre 17 y 46%.
En pacientes con obesidad severa sometidos a cirugía bariátrica, la prevalencia de NAFLD puede superar el 90% y hasta el 5% pueden tener cirrosis.
En la actualidad, la prueba de oro para el diagnóstico de la esteatosis hepática es el análisis histológico mediante biopsia hepática.
Sin embargo, su uso está sujeto a ciertas controversias debido a sus limitaciones:
-Presenta tasas de morbilidad de hasta el 1% (sangrado, dolor, perforación de órganos) y de mortalidad de hasta 0,01%.
-La biopsia percutanea estudia una pequeña muestra que puede resultar poco representativa
-Además requiere de la disponibilidad de un experto en patología y unas condiciones mínimas de laboratorio de anatomía patológica, que en el caso de la extracción de hígado en el trasplante encarece el gasto del procedimiento.
La AASLD (American Assotiation of study of liver disease) restringe la biopsia hepática a casos en los que existe alta sospecha clínica de fibrosis o para diagnóstico diferencial con otras enfermedades.
El objetivo del tratamiento de la esteatosis hepática consiste en mejorar la infiltración grasa del hígado y prevenir la fibrosis. El pilar del tratamiento de la esteatosis hepática consiste en realizar cambios en el estilo de vida encaminados a la pérdida de peso, mediante dieta y ejercicio físico. Se ha demostrado que la pérdida de peso de 5-10% mejora la resistencia insulínica, los niveles de enzimas hepáticos y el daño histológico hepático. Las intervenciones farmacológicas para los pacientes con esteatosis se basan en fármacos dirigidos a tratar los componentes subyacentes del síndrome metabólico o bien en fármacos que traten la patogénesis subyacente (estrés oxidativo).
HIPÓTESIS
•La melatonina es un tratamiento efectivo para revertir la esteatosis hepática establecida e inducida mediante una dieta especial en un modelo animal porcino.
•El modelo de esteatosis basado en alteraciones en la dieta evitando la toxicidad celular directa, desarrollado por nuestro equipo de investigación, es un modelo efectivo y reproductible para inducir un alto grado de esteatosis hepática en pocas semanas.
•La melatonina es un tratamiento eficaz para mejorar los parámetros serológicos de función hepática en la esteatosis inducida mediante dieta especial en un modelo animal porcino.
•La melatonina es un tratamiento eficaz para mejorar los parámetros de estrés oxidativo producidos en la esteatosis hepática inducida mediante dieta especial en un modelo animal porcino.
•Modificaciones en la dieta habitual encaminadas a reducir la ingesta de grasas produce una mejoría en el grado de esteatosis hepática a nivel histológico, así como mejoría de los datos serológicos de función hepática y de los parámetros de estrés oxidativo.
•El análisis digital de imágenes diseñado por nuestro grupo de investigación como método de determinación del grado de esteatosis hepática es un método válido, sencillo y libre de subjetividad.
ESTUDIOS PREVIOS
Se realizó un estudio experimental previo con 6 cerdos Largue White-Landrace. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
•Se observó una mejoría del 10-20% del grado de esteatosis con regeneración de los hepatocitos centrolobulillares en 3 de las 6 muestras.
•En las otras 3 muestras, el porcentaje de esteatosis se mantiene pero no aumenta a pesar de mantener la dieta esteatósica en combinación con melatonina.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio experimental prospectivo realizado en animal de experimentación, utilizando un modelo animal porcino.
Tras tres meses de alimentación especial, fueron sometidos a un procedimiento quirúrgico con anestesia general para obtener una muestra suficiente de hígado para estudio, así como muestras de sangre.
Tras la intervención, los cerdos esteatósicos fueron asignados a 4 grupos de estudio.
Grupo 1: animales que continuaron con la dieta esteatósica durante 1 mes más y concomitantemente se les administró melatonina.
Grupo 2: animales que continuaron con la dieta esteatósica durante 1 mes más y no se les administró melatonina.
Grupo 3: animales que no continuaron con la dieta esteatósica y se les administró melatonina durante 1 mes.
Grupo 4: animales que no continuaron con la dieta esteatósica y no se les administró melatonina.
También se realizó un grupo control con 6 cerdos, que fueron animales sanos sin esteatosis, sometidos a dieta normal no esteatósica desde el inicio.
La dieta administrada fue una dieta especial para producir esteatosis hepática, basada en un alto contenido en grasa saturada, deficiente en metionina, suplementada con 2% de colesterol y 0,5% de colato sódico.
Los animales pertenecientes a los grupos de estudio 1 y 3 recibieron dosis de melatonina de 10 mg/kg/día vía oral. Se administró una única toma diaria durante un mes por medio de cápsulas que fueron ingeridas mezclada con la alimentación.
La muestra de tejido hepático se seccionó y se obtuvieron dos partes, una de ellas conservada en Formaldehido para el estudio anatomo-patológico y la otra parte fue congelada con nitrógeno líquido para el estudio de parámetros de estrés oxidativo.
La muestra sanguínea fue centrifugada para obtener suero. De esta muestra obtuvimos los parámetros de función hepática y lípidos sanguíneos.
Se estudiaron 22 variables agrupadas en 4 categorías:
-Características macroscópicas:
-Tamaño del hígado.
-Bordes del hígado
-Coloración del hígado.
-Consistencia.
-Ascitis.
-Peso del animal.
-Estudio bioquímico de muestra sanguínea:
-Triglicéridos.
-Colesterol Total.
-HDL colesterol.
-LDL colesterol
-AST.
-ALT.
-GGT.
-FA.
-G.
-Estudio bioquímico de estrés oxidativo de la biopsia hepática.
-MDA.
-Carbonilos.
-Análisis histológico de la biopsia hepática.
-Grado de esteatosis bajo visión directa del patólogo.
-Grado de esteatosis según programa informático de tratamiento de imágenes.
-Distribución de la esteatosis.
-Morfología de la esteatosis.
-Grado de fibrosis.
En nuestro estudio realizamos la Cuantificación de la esteatosis mediante análisis asistido por ordenador, con el objetivo de realizar una cuantificación objetiva disminuyendo la subjetividad interobservador.
RESULTADOS
Participaron un total de 41 animales que se recibieron en tres tandas entre 2012 y 2014. 35 animales iniciaron dieta esteatósica y 6 animales formaron parte del grupo control. De los 35 animales que iniciaron la dieta esteatósica, 4 animales murieron después de la primera biopsia por complicaciones intra o postoperatorias. Estos 4 animales se repusieron para no afectar al tamaño muestral. Por lo tanto, los 4 grupos de estudio los formaron 31 animales. Se perdieron 4 animales en el estudio.
Los 31 animales del grupo de estudio se distribuyeron de la siguiente manera en los diferentes grupos: Grupo 1: 12 animales, grupo 2: 9 animales, grupo 3: 5 animales, grupo 4: 5 animales.
La mayoría de animales alcanzaron un grado de esteaosis superior al 70% según visión directa del patólogo.
Variable peso: todos los grupos todos los grupos de estudio aumentaron su peso en la segunda biopsia o tiempo post con respecto a la primera biopsia, especialmente los grupos 3 y 4 que son los grupos que no continuaron con la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, que evalúa las variables dieta y melatonina de manera independiente sobre el porcentaje de cambio de peso, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de peso.
Variable triglicéridos: lo más destacado es que existe un descenso del valor medio en los grupos 3 y 4, que son los grupos que no han continuado con la dieta esteatósica, siendo este descenso significativo en caso del grupo 4, con un p de 0,043. En el modelo de regresión lineal, se observa que ni la dieta ni el tratamiento con melatonina ejercen una influencia en la variación de TG.
Variable colesterol total: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que han discontinuado la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de Colesterol Total.
Variable HDL: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que han discontinuado la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de HDL.
Variable LDL: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que han discontinuado la dieta esteatósica. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación de LDL.
Variable B: se produce un descenso del valor medio en todos los grupos, aunque este descenso de B en la segunda biopsia con respecto a la primera, sólo es significativo en el grupo 2. No observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de B, ya que no hay diferencias significativas en el porcentaje de cambio al comparar por grupos, y así se demuestra en el modelo de regresión lineal.
Variable AST: lo más destacado es que existe un descenso significativo del valor medio en los grupos 2 y 4, que son los grupos que no han tomado melatonina, con una p de 0,008 y 0,043 respectivamente. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la melatonina sobre la variación de AST.
Variable ALT: existe un AUMENTO del valor medio en los grupos 3 y 4 de manera significativa, con una p de 0,043 y 0,042 respectivamente, que son los grupos que no han continuado con la dieta esteatósica.
Variable GGT: existe un descenso del valor medio significativo en los grupos 3 y 4, con una p de 0,043, que son los grupos que no han continuado con la dieta esteatósica. No observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de GGT.
Variable FA: existe un descenso del valor medio significativo en el grupo 4, con una p de 0,043, que son los animales que no han continuado con la dieta esteatósica y no han tomado melatonina. No observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de GGT, ya que no hay diferencias significativas en el porcentaje de cambio al comparar por grupos, y así se demuestra en el modelo de regresión lineal.
Variable grado de esteatosis analizada bajo visión directa patólogo: en los grupos 3 y 4 (animales que no continuaron la dieta esteatósica), el grado de esteatosis disminuye de manera notable, mientras que en los grupos 1 y 2 el grado de esteatosis aumenta discretamente. El modelo de regresión lineal, confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación del grado de esteatosis.
Variable grado de esteatosis medido por programa de análisis digital de imagen: en los grupos 3 y 4 (animales que no continuaron la dieta esteatósica), el grado de esteatosis disminuye de manera notable, al igual que ocurría según el patólogo. Sin embargo según el programa de análisis digital de imagen, el grupo 2 aumenta moderadamente el grado de esteatosis (animales que continuaron con la dieta y no tomaron melatonina), y el grupo 1 permanece prácticamente estable o incluso disminuye ligeramente. Sin embargo, al realizar el modelo de regresión lineal, sólo se confirma el efecto significativo de la dieta y no del tratamiento con melatonina sobre la variación del grado de esteatosis.
Variable MDA: existe un descenso del valor medio en todos los grupos, sin embargo el descenso sólo es significativo para el grupo 1 (animales que han seguido con dieta esteatósica y melatonina). Este dato es interesante para nosotros. Sin embargo, no observamos que el tratamiento con melatonina ni que la discontinuación de la dieta genere ningún efecto en la variación de MDA, ya que no hay diferencias significativas en el porcentaje de cambio al comparar por grupos, y así se demuestra en el modelo de regresión lineal.
Variable Carbonilos: existe un aumento del valor medio en todos los grupos, salvo en el grupo 1 (animales que han continuado con la dieta esteatósica y han tomado melatonina). Sin embargo sólo existe significación estadística para el descenso del grupo 4. El modelo de regresión lineal demuestra que existe una influencia tanto de la dieta como de la melatonina en la variación media de Carbonilos.
DISCUSIÓN
Como conclusiones generales de nuestro trabajo, podemos decir que no hemos podido demostrar a nivel global un efecto beneficioso de la melatonina en la mejoría o reversión de la esteatosis hepática una vez instaurada, inducida por dieta en un modelo animal porcino. No hemos conseguido demostrar el efecto hipolipemiante y citoprotector a nivel hepático de la melatonina, a diferencia de los resultados obtenidos en la literatura en estudios experimentales y en estudios clínicos en humanos. Sin embargo, aunque no hemos obtenido resultados contundentes sobre un efecto beneficioso de la melatonina, hemos encontrado diversos indicios de mejoría a nivel histológico y a nivel de los parámetros de estrés oxidativo. Hemos comprobado en nuestro estudio que, en el análisis histológico de la muestra hepática mediante programa de tratamiento de imágenes (libre de subjetividad), de los animales que continúan con la dieta, los que no consumen melatonina no aumentan de media la esteatosis tanto como los que no la consumen, de manera significativa (p=0,002). En cuanto a los parámetros de estrés oxidativo, el MDA disminuye de manera significativa en el grupo de animales que continúan con la dieta y toman melatonina, aunque no existen diferencias significativas en cuanto a porcentaje de cambio al comparar por grupos. En cuanto a Carbonilos, observamos que de los animales que continúan con la dieta esteatósica, el nivel de carbonilos desciende de manera significativa en los animales tratados con melatonina con respecto a los no tratados (p=0,014).
Si bien es cierto que estos indicios de mejoría de la melatonina a nivel histológico y a nivel de estrés oxidativo, son resultados positivos, ya que nuestro estudio es el primer trabajo realizado en un modelo de grandes animales en el que se estudia el efecto de la melatonina como tratamiento en la reversión de la esteatosis hepática instaurada. Hasta ahora todos los modelos experimentales se realizaban con roedores y la gran mayoría probando la melatonina como prevención de la esteatosis hepática. Sólo en el estudio de Hatzis encontramos similitudes con nuestro estudio, ya que en un grupo de roedores se administró dieta esteatósica durante 8 o 12 semanas y en las últimas 4 semanas se administró melatonina vía intraperitoneal. Los autores de este estudio concluyen que en este grupo de roedores no existe ningún efecto protector de la melatonina en una fase tardía, por lo tanto, es la primera vez que en la literatura se hace referencia a que la melatonina no podría ser eficaz ante la enfermedad hepática ya instaurada.
Los estudios realizados en humanos tienen el hándicap de que no realizan biopsias para corroborar la mejoría de la esteatosis hepática tras la administración de melatonina, probablemente por el porcentaje de complicaciones no desdeñable que conlleva este método diagnóstico.
Con este trabajo podemos demostrar cierto efecto protector de la melatonina en cuanto a menor progresión de la esteatosis en la muestra histológica, sin embargo no podemos demostrar la mejoría, como en otros estudios. Podemos sacar varias reflexiones al respecto.
La primera, a la cual ya se ha hecho referencia, es que en nuestro trabajo partimos de niveles de esteatosis muy elevados. Los estudios experimentales en roedores administran la melatonina de manera concomitante con la dieta rica en grasas, por lo que pretenden encontrar un efecto protector de la melatonina en la instauración de la esteatosis hepática, no la reversión de la esteatosis hepática, que es el objetivo de nuestro estudio. Por otra parte, en los estudios realizados en humanos el grado de esteatosis del que se parte no llega a los niveles tan elevados de esteatosis de los que partimos nosotros. Por lo tanto es posible que la melatonina tenga un efecto preventivo de la lesión hepática o incluso sirva como tratamiento de la esteatosis hepática cuando el grado de afectación grasa de los hepatocitos es menor, siendo difícil su reversión cuando la afectación hepatocitaria es mayoritaria y no cesa el estímulo que la produjo.
Otro aspecto a tener en cuenta es el tiempo de administración de melatonina. Hemos visto que en nuestro estudio se obtienen resultados positivos a nivel molecular, en el mecanismo íntimo de producción de NAFLD, es decir, observamos que la melatonina atenua el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica en los grupos de animales que continúan con la dieta, sin embargo los cambios a nivel histológico han sido solo de prevenir la progresión. Esto puede ser debido a que el período de administración de melatonina (1 mes) o la dosis administrada (10 mg/kg/día) es insuficiente para observar cambios en la acumulación de lípidos hepatocitarios a nivel histológico. Se necesitarían estudios con un tiempo de administración más prolongado de melatonina o con una dosis mayor para demostrar este efecto.
CONCLUSIONES
1.Nuestro modelo experimental de esteatosis en grandes animales basado en modificaciones de la dieta, es capaz de provocar cambios histológicos hepáticos similares a NAFLD con grados de infiltración grasa por encima del 40% tras 3 meses de dieta.
2.La medición del grado de infiltración grasa del hígado estimada subjetivamente por el patólogo magnifica el porcentaje de esteatosis comparado con el método de medición realizado con ayuda de un programa informático de tratamiento de imágenes.
3.La melatonina administrada vía oral en una sola toma a dosis de 10 mg/kg/día durante 4 semanas es incapaz de revertir la esteatosis hepática en un modelo de hígado graso porcino con elevados grados de infiltración grasa.
4.La melatonina administrada vía oral en una sola toma a dosis de 10 mg/kg/día durante 4 semanas es incapaz de modificar los niveles de lípidos plasmáticos ni los parámetros serológicos de daño hepático provocados por la dieta inductora de esteatosis.
5.La melatonina administrada vía oral en una sola toma a dosis de 10 mg/kg/día durante 4 semanas produce un efecto de disminución de la peroxidación lipídica medida mediante la disminución de MDA y medido mediante la disminución de los Carbonilos.
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Abstract (other lang.):
Pal. clave: esteatosis hepática ; nash ; nafld ; melatonina
Titulación: Programa de Doctorado en Medicina
Plan(es): Plan 497
Knowledge area: Anatomía patológica
Department: Cirugía, Ginecología y Obstetricia
Nota: Presentado: 12 05 2017
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Cirugía, Ginecología y Obstetricia, 2017
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