Mutagénesis dirigida y ensayo enzimático de la mutación R501P en el gen HMGCS2

Gil Clavero, Sergio
Pié Juste, Juan (dir.)

Universidad de Zaragoza, MED, 2017
Departamento de Farmacología y Fisiología, Área de Fisiología

Graduado en Medicina

Resumen: Introducción: la deficiencia de HMG-CoA sintasa mitocondrial humana es un error congénito del metabolismo que muestra un patrón de herencia autosómico recesivo. Tiene muy baja prevalencia. Está producida por mutaciones en homocigosis o heterocigosis compuesta del gen HMGCS2. Fue descrita por primera vez en 1997. La enzima mHS tiene un rol importante en la cetogénesis, ya que es la encargada de catalizar la condensación del acetil-CoA y el acetoacetil-CoA para formar HMG-CoA en las mitocondrias de los hepatocitos. Su clínica es muy inespecífica y se caracteriza por crisis agudas de hipoglucemia con hipocetonemia. Los síntomas más frecuentes son náuseas, vómitos, irritabilidad y letargia. Sin tratamiento, puede progresar a encefalopatía, coma y muerte. Material y métodos: en este trabajo se ha utilizado un método de mutagénesis dirigida y ensayo enzimático “in vitro” para medir la actividad de la variante alélica R501P, reportada por primera vez. Para llevarlo a cabo, se han empleado células de Escherichia coli usando el vector de expresión pMAL-c2X-mHS. Posteriormente, el efecto de cada mutación en la estructura de la proteína ha sido analizado con un modelo bioinformático en 3D. Además, se ha comparado su actividad con la de la proteína wild-type (WT) y con la variante R501Q, previamente reportada y de localización análoga en la proteína. Resultados: todas las proteínas recombinantes se han conseguido obtener solubles en disolución. La proteína WT ha alcanzado una concentración de 0,298μg/μl y una actividad enzimática de 0,910 U/mg, mientras que las variantes R501P y R501Q han presentado una concentración de 0,241μg/μl y 0,304μg/μl respectivamente y una ausencia total de actividad. Las predicciones bioinformáticas se correlacionan con estos resultados: el efecto producido en ambas mutaciones es la distorsión de una zona de la proteína próxima a la superficie de dimerización, impidiendo así su actividad catalítica. Discusión: por tercera vez se ha comprobado la buena reproductibilidad del método de expresión, purificación y ensayo enzimático de la enzima mHS humana. Debido a la inespecificidad del diagnóstico clínico y bioquímico, el estudio molecular y la caracterización funcional de las mutaciones “in vitro” emerge como el método de elección para el diagnóstico de certeza de estos pacientes.

Tipo de Trabajo Académico: Trabajo Fin de Grado