Caracterización subcelular y por tejidos de la isoenzima HMG-COA Liasa Like 1

Arnedo Muñoz, María
Pie Juste, Juan (dir.) ; Puisac Uriol, Beatriz (dir.)

Universidad de Zaragoza, 2011

Resumen: La proteína HMG-CoA Liasa humana (HL) es una enzima codificada por el gen HMGCL cuyo déficit provoca la aciduria 3-hidroxi-3-metilglutárica (OMIM 246450), enfermedad genética poco frecuente, de carácter autosómico recesivo, que afecta a la ruta de síntesis de cuerpos cetónicos. En el año 2004 se localizó en la base de datos `NIH The Mammalian Gene Collection¿ (MGC) un nuevo gen, el HMGCLL1, que tenía una gran homología con el gen HMGCL. Los primeros resultados mostraron diferencias, pero también similitudes, entre ambos genes y proteínas. Sin embargo, quedaron sin responder aspectos importantes a los que se intentó dar respuesta en este trabajo. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: 1.Confirmar y definir el modelo estructural de la HL-Like1 mediante el intercambio de mutaciones homólogas entre los genes HMGCL y HMGCLL1. 2.Identificar y caracterizar las posibles variantes fisiológicas de splicing del gen HMGCLL1. 3.Localizar a nivel subcelular la enzima HL-Like1 y estudiar la interacción de la nueva enzima con la membrana del retículo endoplásmico. 4.Caracterizar las constantes cinéticas de la nueva isoenzima y su actividad por tejidos. 5.Caracterizar el nivel de proteínas HL y HL-Like1 en tejidos adultos y fetales desarrollando un anticuerpo específico para la nueva enzima. 6.Estudiar la interacción de la HL-Like1 con la tubulina. Para la realización del primer objetivo se reprodujeron mutaciones que provocaban la pérdida de actividad de la enzima HL en los aminoácidos homólogos de la HL-Like1 por medio de mutagénesis dirigida. Los resultados obtenidos mostraron la total falta de actividad de las proteínas HL-Like1 mutadas, lo que confirmaba de manera experimental la gran homología existente entre ambas isoenzimas y la validez del modelo tridimensional propuesto. Para la caracterización e identificación de posibles variantes de splicing se emplearon dos estrategias, una basada en la búsqueda en bases de datos y otra experimental de amplificación por fragmentos solapantes. Los resultados mostraron a la ¿variante b¿ como la principal del gen HMGCLL1, además de un gran número de tránscritos alternativos. Estos se podían clasificar en variantes con inserción de exones (¿variante a¿ y ¿variante c¿), y con deleción de exones. Las variantes de inserción parecían tener poca importancia al ser muy minoritarias y las de deleción no traducían proteínas activas. Las formas delecionadas eran sobre todo abundantes en tejidos adultos. El siguiente paso fue conocer la localización subcelular de nuestra proteína. Para ello se realizó un clonaje empleando proteínas fluorescentes, cuyo resultado fue que la HL-Like1 se localizaba en el retículo endoplásmico de las células. Para completar este estudio, se hicieron experimentos de asociación y disociación de la proteína a las membranas del retículo, estos mostraron que la HL-Like1 endógena se localizaba en las membranas del retículo endoplásmico y que además tenía la capacidad para disociarse de las mismas, comportándose como una proteína periférica. Además su interacción con la tubulina sugería que estaba orientada hacia el citosol celular. La caracterización de las constantes cinéticas de ambas proteínas mostró también diferencias en cuanto al nivel de actividad y a la afinidad por el sustrato. La HL-Like1 alcanzaba una velocidad máxima menor que la HL sin embargo, su afinidad por el sustrato era mayor. Estos datos confirmaban que nos encontrábamos ante enzimas de igual actividad pero con parámetros cinéticos diferentes. Otro objetivo de este trabajo fue conocer si existían diferencias en cuanto al nivel de actividad y de expresión por tejidos entre la HL-Like1 y la HL. Los experimentos de western-blot en tejidos fetales mostraron que la HL-Like1 sólo se expresaba en cerebro fetal. Sin embargo, su presencia en tejidos adultos era más variada, siendo elevada en pulmón, riñón y cerebro. Los ensayos enzimáticos arrojaron resultados similares y destacaron la elevada actividad de pulmón y cerebro. Estos tejidos coinciden en utilizar los cuerpos cetónicos como sustratos en la síntesis de lípidos complejos y sugieren que las funciones de la HL estarían más orientadas al metabolismo energético, mientras que las de la HL-Like1 podrían estarlo más hacia el metabolismo plástico. Finalmente, se estudió la influencia de la tubulina acetilada sobre la HL-Like1. Los experimentos de co-inmunoprecipitación y de actividad demostraron la interacción entre ambas proteínas y que la tubulina era capaz de activar a la HL-Like1 in vitro.

Pal. clave: biología celular

Área de conocimiento: Farmacología

Departamento: Farmacología y Fisiología

Nota: Presentado: 28 10 2011

Nota: Tesis-Univ. Zaragoza