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Biomedical applications of magnetic nanoparticles: Magnetic hyperthermia in dendritic cells and magnetofection in brain cells

Asín Pardo, Laura
Ibarra García, Manuel Ricardo (dir.) ; Goya, Gerardo Fabián (dir.)

Universidad de Zaragoza, 2012

Resumen: La nanociencia es hoy en día un área de investigación que ofrece grandes avances a varias disciplinas, entre ellas, la biología es una de las más importantes por las posibles aplicaciones biomédicas que pueden ser desarrolladas gracias a la sinergia de ambos campos. Dichas aplicaciones pueden revolucionar los campos diagnóstico y terapéutico de la medicina. ¿Drug delivery¿ [1, 2], hipertermia magnética [3-5], transfección/transducción con complejos magnéticos [6], marcaje celular [7, 8] y Resonancia Magnética de Imagen (RMI) [9, 10] son ejemplos de aplicaciones biológicas en las que la nanociencia está aportando avances. En este trabajo nos hemos centrado principalmente en dos de estas aplicaciones, la hipertermia magnética en células dendríticas (DCs) y la transducción con complejos magnético-adenovirales en células neuronales y gliales. Dentro del campo de la medicina clínica el término hipertermia se utiliza para referirse al aumento de temperatura, generado por cualquier técnica, que se utiliza como adyuvante de otras terapias como la quimioterapia o radioterapia en tratamientos oncológicos. Hay varias técnicas para producir un aumento de temperatura local, entre ellas está la hipertermia magnética, en la que se hace uso de nanopartículas magnéticas (MNPs) y de un campo magnético externo. Las MNPs en presencia de una campo magnético ac tienen la propiedad de liberar energía en forme de calor mediante varis mecanismos distintos. La estrategia general del trabajo realizado en este campo es la utilización de DCs como vectores para transportar MNPs a la zona tumoral. Esta idea se basa en la evidencia demostrada en la literatura de que las DCs en presencia de factores de crecimiento generados por parte de tumores son capaces de diferencias a células endoteliales y pasar a formar parte de los nuevos vasos sanguíneos generados para ¿alimentar¿ el tumor [11]. De esta forma, si a través de la aplicación de campos magnéticos externos se es capaz de ocasionar la muerte de estas células, que previamente han captado MNPs, se estaría ayudando a provocar la recesión del tumor. Por otro lado, la otra parte del trabajo está centrada en la utilización de MNPs para la formación de complejos MNPs-adenovirus para la transducción de células neuronales y gliales. Esta parte del trabajo esta englobada en un proyecto que tiene como objetivo principal la terapia génica en enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer o el Parkinson, que suponen un problema de salud pública cada vez mayor debido a que la esperanza de vida aumenta y con ello la existencia de personas de avanzada edad con este tipo de trastornos. El término de magnetofección es definido como el aporte de ácidos nucleicos a una célula utilizando un campo magnético externo que actúa sobre complejos formados entre el vector del acido nucleico y MNPs. De esta forma se potencia uno de los primeros pasos que tiene que ocurrir para que ocurra una trasnfeccción/transducción exitosa, el contacto vector-célula. El objetivo general al utilizar esta técnica es conseguir mejorar la eficiencia de trasnfección-transducción y por lo tanto poder utilizar cantidades menores de vectores virales, en el caso de la trasnducción, y de esta forma minimizar los posibles efectos secundarios [12]. II. Estudios realizados En lo que refiere a la primera parte del trabajo, la hipertermia en DCs, se empezó realizando experimentos para estudiar la interacción MNPs-célula. Para todos estos experimentos se utilizaron unas partículas comerciales que consistían en un núcleo de magnetita y recubrimiento de dextrano, confiriendo un radio hidrodinámico de 250 nm. Las partículas tenían un recubrimiento de grupos carboxilo que le aportaban cargas negativas. Lo primero que se realizo fue poner a punto el protocolo de extracción de monocitos de sangre buffy coats y su posterior diferenciación a DCs. Además, para poder determinar si las células eran capaces de incorporar las MNPs se realizaron estudios de microscopia electrónica de transmisión y microscopia confocal, utilizando unas NPs análogas a las descritas anteriormente pero que contenían un derivado de rhodamina. Además re realizó microscopia electrónica de barrido para comprobar que las NPs no quedaban adheridas a la membrana, pudiendo ver que las DCs contenían las NPs a través de las imágenes tomadas a partir de los electrones retrodispersados. Para estudiar el efecto de toxicidad que tenían estas partículas en este tipo celular se realizaron tres tipos diferentes de ensayos de viabilidad: Azul Trypan, MTT y marcaje de Ioduro de Propidio (IP) y AnnexinaV mediante FACS. Se realizaron ensayos de toxicidad con diferentes cantidades de MNPs y diferentes tiempos de incubación, llegando hasta 5 días. Se analizó también el efecto de las MNPs en cuanto a la maduración de las DCs, debido que la incubación MNPs-DCs se hace con DCs inmaduras ya que el incorporación de diferentes antígenos-partículas es óptima. Para ello se analizó por FACS la expresión de diferentes moléculas de membrana de DCs y se determinó la concentración, mediante un Luminex, de diferentes Interleuquinas liberadas al medio por parte de las DCs. Además, se realizaron estudios de incorporación de MNPs por parte de las DCs, por un lado utilizando NPs fluorescentes mediante FACS se analizó la incorporación de las mismas a distintas concentraciones de incubación con las DCs y por otro lado mediante magnetometría SQUID se determinó el valor medio de MNPs incorporadas per cada célula también a distintas concentraciones de incubación. La segunda parte del trabajo con las DCs es todo lo relacionado con la aplicación del campo magnético externo una vez las DCs han captado las MNPs. Los primeros experimentos se hicieron a condiciones fijas de concentración de NPs, amplitud del campo magnético y tiempo y en los próximos se exploró como la influencia de estos parámetros en la muerte celular provocada en las DCs cargadas con MNPs, tanto en lo que se refiere al % de células muertas como al mecanismo de muerte celular. Además se hicieron estudios de la toxicidad del sobrenadante de las DCs que morían tras ser expuestas al campo magnético. Cambiando a la otra parte del trabajo realizado acerca de magnetotransducción en células gliales y neuronales, las primeras experiencias se centraron en la formación de los complejos entre los adenovirus y tres tipos diferentes de MNPs a diferentes proporciones virus:MNPs. Utilizando radioactividad se midió la cantidad de virus que quedaba sin formar los complejos, por lo que se determinó la propoción virus:MNPs óptima para que no quedara virus sin unir a MNPs y para no añadir exceso de MNPs. A continuación se realizó la caracterización de los complejos, midiendo si radio hidrodinámico, su potencial z y su respuesta magnética, este último parámetro se obtuvo midiendo la velocidad a la que se movían los complejos en presencia de un campo magnético. Se realizaron estudios de citotoxicidad del virus y de los complejos en las células que iban a ser utilizadas en los experimentos de infección y además haciendo uso de virus marcados radiactivamente se pudo determinar la fracción de virus que había sido internalizada por célula, cuando la infección se realizaba solo con el virus o con complejo adenovirus-MNPs. El siguiente paso fue estudiar la eficiencia en la transducción en los dos tipos de células por separado, de los virus solos y de los complejos. El adenovirus utilizado codificaba para la proteína verde fluorescente (GFP) por lo que le método que se utilizó para estudiar la transfección positiva fue el FACS, midiendo la fluorescencia verde de cada célula. Debido a que en el cerebro estos dos tipos de células se encuentran interactuando directamente en una proporción 9:1 (gliales : neuronales) se realizaron también estudios de eficiencia en la transducción de estas células en cocultivos que se asemejaran más al ambiente real de estas células. Para ello se tuvo que manipular una de las dos líneas, concretamente las gliales, para que expresaran una proteína roja con el objetivo de poder seguir distinguidas de las neuronales mediante FACS. Esto se hizo infectando estas células con un lentivirus que codificaba para dicha proteína. Por último se aplicaron las técnicas de microscopía electrónica de barrido y dual beam para observar las células infectadas por los complejos adenovirus:MNPs y para poder observar la estructura de los complejos por si solos. III. Conclusiones A continuación voy a mencionar las principales conclusiones que se pueden extraer de los resultados presentados en esta tesis. Vamos a dividir las conclusiones en los dos temas principales. Aplicación de campos magnéticos alternos en DCs: Una de las conclusiones principales es que las células dendríticas son capaces de internalizar las nanopartículas magnéticas que hemos testado sin presentar ningún efecto de citotoxicidad. Las MNPs se encuentran localizadas en vesículas endosómicas/fagocíticas en el citoplasma de las células, nunca en el núcleo debido a su gran tamaño. Es posible cuantificar la cantidad promedio de MNPs incorporadas por célula a través de medidas de SQUID. La media de MNPs incorporadas por célula (cuando la concentración de las MNPs en la incubación es de 50 µgFe3O4/ml) es de 1.5pgFe3O4/célula (1 pgFe/célula o 250 MNPs/célula). La incorporación de las MNPs por parte de las DCs inmaduras provoca un efecto de maduración dependiente de la concentración de MNPs. La maduración es manifestada en un cambio del perfil de expresión de los marcadores de membrana y en un cambio en las citoquinas liberadas por las células. Cuando sometemos a estas células a un campo magnético alterno se produce muerte celular. Este efecto destructivo es específico de las células cargadas con MNPs. El campo o las MNPs per se no tienen ningún efecto nocivo sobre las DCs. Es importante resaltar que durante la aplicación del campo no se observa aumento de temperatura del medio extracelular. Una posible explicación de porqué las células cargadas con MNPs mueren en ausencia de aumento de temperatura podría ser la siguiente; el destino final de las MNPs, bien a través de endocitosis o fagocitosis, son los lisosomas. Por tanto cuando las MNPs son sometidas al campo magnético alterno se podría producir la ruptura de estos orgánulos por algún proceso mecánico y la liberación repentina y masiva del contenido lisosomal al citoplasma celular provocar la muerte celular. Los estudios acerca del mecanismo de muerte celular realizados por citometría de flujo revelan que se trata de un mecanismo de tipo necrótico. A través de imágenes de microscopia electrónica de barrido se ha podido observar unas perforaciones en la membrana celular tras la aplicación del campo magnético que seguro contribuyen a la muerte de las células. Se ha demostrado que se puede controlar el porcentaje de células que mueren tras la aplicación del campo variando parámetros como la cantidad de MNPs incorporadas, la magnitud del campo magnético y el tiempo de exposición. Construcción de complejos magnético-virales y su uso en magnetofección: Se ha optimizado la construcción de complejos formados por adenovirus y nanopartículas magnéticas. La relación óptima para la unión entre ambos componentes es de 2.5 fgFe/PV (partícula viral). La estabilidad de los complejos en medios biológicos como en Suero Fetal Bovino y el Fluido Cerebrospinal disminuye hasta un 50% debido a la presencia de proteínas en el medio. Los estudios de internalización de adenovirus en células infectadas sólo con el virus o con los complejos y en presencia de un imán externo revelan que la internalización del virus incrementa entre 5-7 veces cuando la infección se hace con los complejos magnéticos y bajo la influencia de un campo magnético externo. Además la internalización de las MNPs en el proceso de infección se puede observar a través de Dual Beam. Los estudios de citotoxicidad informan de que la toxicidad provocada por los complejos es mayor que la provocada por el virus solo. La viabilidad celular nunca decae por debajo del 50% incluso en las concentraciones de complejo más altas. Para aplicaciones in vivo se espera utilizar concentraciones mucho más bajas por lo que la citotoxicidad apenas sería perceptible. En lo que se refiere a la eficiencia de la transfección, analizando la expresión del gene informador (GFP en nuestro caso), se ha demostrado que ésta se ve incrementada cuando la infección se realiza con los complejos y bajo el efecto de un campo magnético. El porcentaje de células que expresan la proteína verde aumenta cuando se lleva a cabo la magneto-transducción para ambos tipos celulares. De las dos líneas celulares utilizadas, las N2A muestran un incremento en la eficiencia del proceso más moderado y observable en mayor grado para concentraciones de complejos más pequeñas (hasta 100 MOI). Sin embargo, para las células B92 el incremento de la eficiencia de la transfección es completamente drástico aumentando hasta 80 veces la cantidad de células transfectadas positivamente. Los estudios de transfección de ambas líneas celulares en co-cultivo (7:3, N2A:B92) revelan que la eficiencia del proceso en las células N2A disminuye mientras que para las B92 se mantiene intacto.