Domingo Tomás, Paula
González Orti, Noelia (dir.) ; Gil Huerta, Lydia (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2019
Resumen: La inseminación artificial (IA) con semen refrigerado es la práctica más común en las explotaciones cunícolas, por lo que cualquier mejora en la misma ayudaría a aumentar significativamente su eficiencia. Por otro lado, la congelación espermática en cunicultura es un método utilizado únicamente en investigación o para la preservación de especies en peligro de extinción, debido a la baja tasa de supervivencia espermática tras la descongelación seminal. De este modo, una mejora en la técnica de congelación facilitaría el almacenamiento de recursos genéticos y el transporte de material genético sin la necesidad de transportar animales vivos. Por último, la liofilización de espermatozoides es un método muy innovador que aún está en proceso de desarrollo. La puesta a punto de este método supondría un gran avance en la reproducción asistida, ya que facilitaría el almacenamiento de dosis seminales durante largos períodos de tiempo sin la necesidad de utilizar nitrógeno líquido (LN2). Por todo ello, el principal objetivo de este trabajo fue investigar los diferentes puntos críticos de los procesos de refrigeración, congelación y liofilización espermática con el fin de mejorar la preservación seminal en la especie cunícola.
El objetivo de la primera experiencia fue evaluar si el plasma seminal (SP) puede mejorar la calidad de los espermatozoides almacenados a 16ºC durante 72 horas y también evaluar el efecto protector del glicerol, DMF y NMP. Las muestras seminales se homogeneizaron y dividieron en ocho fracciones. Una de ellas se diluyó con INRA 96® (diluyente A) y las otras tres con INRA 96® y un crioprotector (CP) al 6%: glicerol (diluyente B), DMF (diluyente C) o NMP (diluyente D). Las otras cuatro fracciones se centrifugaron y el sobrenadante se descartó para eliminar el SP. A continuación, cada muestra se resuspendió con el diluyente A, B, C o D, respectivamente. Todas las muestras se almacenaron a 16ºC y se analizaron a las 4, 24, 48 y 72 horas mediante el sistema integrado de análisis de semen (ISAS®) y las pruebas de vitalidad, test hipoosmótico (HOS test) e integridad del acrosoma. Tras analizar los resultados, las muestras procesadas con SP mostraron un mayor porcentaje (p=0.020) de espermatozoides con la membrana plasmática sin dañar (71,9±1,6%) que las muestras procesadas sin SP (66.5±1.6%). Por otro lado, los espermatozoides sin SP obtuvieron mejores parámetros cinéticos. Los diluyentes A y C mostraron excelentes resultados en MOT (63.1±4.3% diluyente A; 63.4±3.7% diluyente C), vitalidad (88.9±2.6% diluyente A; 87.7 ± 2.7% diluyente C) y HOS test (68.9±1.4% diluyente A; 75.2±1.4% diluyente C). Los peores resultados fueron obtenidos por los diluyentes B y D. Estos resultados sugieren que el SP ejerce una acción protectora en las membranas de los espermatozoides de los conejos y mantiene la MOT. La adición de glicerol y NMP a un diluyente de refrigeración base como INRA 96® no mejora la calidad del esperma del conejo. Sin embargo, la DMF ejerce un efecto protector sobre la membrana de los espermatozoides mejorando la calidad seminal durante la preservación del esperma del conejo a 16ºC.
En la segunda experiencia se valoró el efecto de diferentes CP como el glicerol, DMF y NMP en espermatozoides de conejo refrigerados a dos temperaturas (16ºC y 4ºC) durante 72 horas. Las muestras seminales se dividieron en cuatro fracciones y se diluyeron con: INRA 96® (diluyente A) e INRA 96® con un CP al 6%: glicerol (diluyente B), DMF (diluyente C) o NMP (diluyente D). Posteriormente cada muestra se dividió en dos tubos eppendorf para ser almacenada a 16ºC y 4ºC. Se analizaron a las 4, 24, 48 y 72 horas con el programa ISAS® y se realizaron las pruebas vitalidad, HOS test y la integridad del acrosoma. Como resultado, el diluyente C mostró una mayor MOT, vitalidad y HOS test que el extender B y D (p<0.050). A pesar de que la calidad seminal disminuyó con el tiempo (p<0.050), se observó que a las 24 horas de almacenamiento, las muestras procesadas con DMF mantuvieron una mejor MOT y un mayor porcentaje de espermatozoides con la membrana plasmática sin dañar. Estos resultados sugieren que la adición de glicerol y NMP a INRA 96® no ofrece ventajas. Sin embargo, se ha demostrado que la adición de DMF a INRA 96® ejerce un efecto protector sobre la membrana de los espermatozoides mejorando la calidad seminal. La temperatura de almacenamiento entre 16ºC y 4ºC no afectó la calidad de los espermatozoides de los conejos.
El objetivo de la tercera experiencia fue encontrar un protocolo adecuado para mejorar la criopreservación de espermatozoides de conejo analizando el papel que desempeña el SP y diferentes CP sobre la calidad seminal en el momento de la descongelación y transcurridas 2 horas. Las muestras seminales se homogeneizaron y se dividieron en ocho fracciones. Una de ellas se diluyó con BotuCrio® (diluyente A) y las otras tres con INRA 96® más un CP al 6%: glicerol (diluyente B), DMF (diluyente C) o NMP (diluyente D). Las otras cuatro fracciones se centrifugaron y el sobrenadante se descartó para eliminar el SP. Luego, cada muestra se resuspendió con el diluyente A, B, C o D. Las muestras se enfriaron progresivamente, se cargaron en pajuelas de congelación de 0.5 ml y se congelaron con vapores de LN2. La descongelación se realizó colocando las pajuelas en un baño maría a 37ºC durante 21 segundos. Las muestras se colocaron en tubos eppendorf para su análisis mediante el programa ISAS®, y se realizaron las pruebas de vitalidad, HOS test e integridad del acrosoma. Los mejores resultados de MOT y parámetros cinéticos fueron obtenidos por diluyente A (p<0.050), incluso cuando se comparó la MOT con estudios previos utilizando otros diluyentes. La calidad de los espermatozoides disminuyó a las 2 horas de su descongelación (p<0.050) y no se encontraron diferencias significativas entre las muestras procesadas con o sin SP. Esta experiencia revela que el BotuCrio® podría usarse para la criopreservación de espermatozoides de conejos y, además, que la eliminación del SP durante el proceso de congelación seminal no es necesaria, facilitando y reduciendo el tiempo de procesado de las muestras.
En la cuarta experiencia se intentaron mejorar las condiciones de almacenamiento de muestras de semen liofilizadas añadiendo al medio de liofilización diferentes agentes quelantes como EDTA y EGTA y un antioxidante (ácido rosmarínico). La liofilización se ha aplicado como una tecnología alternativa para preservar recursos genéticos durante largos períodos de tiempo y permitir el envío de espermatozoides a 4ºC entre largas distancias. Sin embargo, el ADN de los espermatozoides puede dañarse debido al estrés mecánico u oxidativo al que son sometidos durante el proceso de liofilización. Para llevar a cabo esta experiencia los espermatozoides de conejo se liofilizaron en medio básico (tampón Tris-HCl 10 mM y NaCl 50 mM) suplementado con EGTA 50 mM (EGTA), EGTA 50 mM más ácido rosmarínico 105 μM (EGTA-RA), EDTA 50 mM (EDTA) o EDTA 50 mM más 105 μM ácido rosmarínico (EDTA-RA). Las muestras de semen se mantuvieron a 4ºC y temperatura ambiente durante 8 meses. Tras la rehidratación, la integridad del ADN se evaluó con el test de dispersión de la cromatina del espermatozoide (SCDt) observando que la fragmentación del ADN era mayor cuando las muestras de semen se liofilizaban con EGTA (10.9%) en vez de EDTA (4.1%) (p<0.001). Además, el ácido rosmarínico actuó mejor en condiciones adversas y no se encontraron diferencias significativas en el almacenamiento a temperatura ambiente. Por ello, la liofilización es un método que puede permitir la conservación de recursos genéticos entre 4ºC y 25ºC durante 8 meses y transportarlos sin la necesidad de LN2 o hielo seco. El agente quelante EDTA es el medio de liofilización más adecuado para preservar semen de conejo liofilizado y la adición de ácido rosmarínico protege el ADN contra el estrés oxidativo causado durante la liofilización.
Resumen (otro idioma):
El objetivo de la primera experiencia fue evaluar si el plasma seminal (SP) puede mejorar la calidad de los espermatozoides almacenados a 16ºC durante 72 horas y también evaluar el efecto protector del glicerol, DMF y NMP. Las muestras seminales se homogeneizaron y dividieron en ocho fracciones. Una de ellas se diluyó con INRA 96® (diluyente A) y las otras tres con INRA 96® y un crioprotector (CP) al 6%: glicerol (diluyente B), DMF (diluyente C) o NMP (diluyente D). Las otras cuatro fracciones se centrifugaron y el sobrenadante se descartó para eliminar el SP. A continuación, cada muestra se resuspendió con el diluyente A, B, C o D, respectivamente. Todas las muestras se almacenaron a 16ºC y se analizaron a las 4, 24, 48 y 72 horas mediante el sistema integrado de análisis de semen (ISAS®) y las pruebas de vitalidad, test hipoosmótico (HOS test) e integridad del acrosoma. Tras analizar los resultados, las muestras procesadas con SP mostraron un mayor porcentaje (p=0.020) de espermatozoides con la membrana plasmática sin dañar (71,9±1,6%) que las muestras procesadas sin SP (66.5±1.6%). Por otro lado, los espermatozoides sin SP obtuvieron mejores parámetros cinéticos. Los diluyentes A y C mostraron excelentes resultados en MOT (63.1±4.3% diluyente A; 63.4±3.7% diluyente C), vitalidad (88.9±2.6% diluyente A; 87.7 ± 2.7% diluyente C) y HOS test (68.9±1.4% diluyente A; 75.2±1.4% diluyente C). Los peores resultados fueron obtenidos por los diluyentes B y D. Estos resultados sugieren que el SP ejerce una acción protectora en las membranas de los espermatozoides de los conejos y mantiene la MOT. La adición de glicerol y NMP a un diluyente de refrigeración base como INRA 96® no mejora la calidad del esperma del conejo. Sin embargo, la DMF ejerce un efecto protector sobre la membrana de los espermatozoides mejorando la calidad seminal durante la preservación del esperma del conejo a 16ºC.
En la segunda experiencia se valoró el efecto de diferentes CP como el glicerol, DMF y NMP en espermatozoides de conejo refrigerados a dos temperaturas (16ºC y 4ºC) durante 72 horas. Las muestras seminales se dividieron en cuatro fracciones y se diluyeron con: INRA 96® (diluyente A) e INRA 96® con un CP al 6%: glicerol (diluyente B), DMF (diluyente C) o NMP (diluyente D). Posteriormente cada muestra se dividió en dos tubos eppendorf para ser almacenada a 16ºC y 4ºC. Se analizaron a las 4, 24, 48 y 72 horas con el programa ISAS® y se realizaron las pruebas vitalidad, HOS test y la integridad del acrosoma. Como resultado, el diluyente C mostró una mayor MOT, vitalidad y HOS test que el extender B y D (p<0.050). A pesar de que la calidad seminal disminuyó con el tiempo (p<0.050), se observó que a las 24 horas de almacenamiento, las muestras procesadas con DMF mantuvieron una mejor MOT y un mayor porcentaje de espermatozoides con la membrana plasmática sin dañar. Estos resultados sugieren que la adición de glicerol y NMP a INRA 96® no ofrece ventajas. Sin embargo, se ha demostrado que la adición de DMF a INRA 96® ejerce un efecto protector sobre la membrana de los espermatozoides mejorando la calidad seminal. La temperatura de almacenamiento entre 16ºC y 4ºC no afectó la calidad de los espermatozoides de los conejos.
El objetivo de la tercera experiencia fue encontrar un protocolo adecuado para mejorar la criopreservación de espermatozoides de conejo analizando el papel que desempeña el SP y diferentes CP sobre la calidad seminal en el momento de la descongelación y transcurridas 2 horas. Las muestras seminales se homogeneizaron y se dividieron en ocho fracciones. Una de ellas se diluyó con BotuCrio® (diluyente A) y las otras tres con INRA 96® más un CP al 6%: glicerol (diluyente B), DMF (diluyente C) o NMP (diluyente D). Las otras cuatro fracciones se centrifugaron y el sobrenadante se descartó para eliminar el SP. Luego, cada muestra se resuspendió con el diluyente A, B, C o D. Las muestras se enfriaron progresivamente, se cargaron en pajuelas de congelación de 0.5 ml y se congelaron con vapores de LN2. La descongelación se realizó colocando las pajuelas en un baño maría a 37ºC durante 21 segundos. Las muestras se colocaron en tubos eppendorf para su análisis mediante el programa ISAS®, y se realizaron las pruebas de vitalidad, HOS test e integridad del acrosoma. Los mejores resultados de MOT y parámetros cinéticos fueron obtenidos por diluyente A (p<0.050), incluso cuando se comparó la MOT con estudios previos utilizando otros diluyentes. La calidad de los espermatozoides disminuyó a las 2 horas de su descongelación (p<0.050) y no se encontraron diferencias significativas entre las muestras procesadas con o sin SP. Esta experiencia revela que el BotuCrio® podría usarse para la criopreservación de espermatozoides de conejos y, además, que la eliminación del SP durante el proceso de congelación seminal no es necesaria, facilitando y reduciendo el tiempo de procesado de las muestras.
En la cuarta experiencia se intentaron mejorar las condiciones de almacenamiento de muestras de semen liofilizadas añadiendo al medio de liofilización diferentes agentes quelantes como EDTA y EGTA y un antioxidante (ácido rosmarínico). La liofilización se ha aplicado como una tecnología alternativa para preservar recursos genéticos durante largos períodos de tiempo y permitir el envío de espermatozoides a 4ºC entre largas distancias. Sin embargo, el ADN de los espermatozoides puede dañarse debido al estrés mecánico u oxidativo al que son sometidos durante el proceso de liofilización. Para llevar a cabo esta experiencia los espermatozoides de conejo se liofilizaron en medio básico (tampón Tris-HCl 10 mM y NaCl 50 mM) suplementado con EGTA 50 mM (EGTA), EGTA 50 mM más ácido rosmarínico 105 μM (EGTA-RA), EDTA 50 mM (EDTA) o EDTA 50 mM más 105 μM ácido rosmarínico (EDTA-RA). Las muestras de semen se mantuvieron a 4ºC y temperatura ambiente durante 8 meses. Tras la rehidratación, la integridad del ADN se evaluó con el test de dispersión de la cromatina del espermatozoide (SCDt) observando que la fragmentación del ADN era mayor cuando las muestras de semen se liofilizaban con EGTA (10.9%) en vez de EDTA (4.1%) (p<0.001). Además, el ácido rosmarínico actuó mejor en condiciones adversas y no se encontraron diferencias significativas en el almacenamiento a temperatura ambiente. Por ello, la liofilización es un método que puede permitir la conservación de recursos genéticos entre 4ºC y 25ºC durante 8 meses y transportarlos sin la necesidad de LN2 o hielo seco. El agente quelante EDTA es el medio de liofilización más adecuado para preservar semen de conejo liofilizado y la adición de ácido rosmarínico protege el ADN contra el estrés oxidativo causado durante la liofilización.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: reproducción animal
Titulación: Programa de Doctorado en Medicina y Sanidad Animal
Plan(es): Plan 498
Departamento: Patología Animal
Nota: Presentado: 08 02 2019
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Patología Animal, 2019
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Registro creado el 2020-05-22, última modificación el 2021-05-20
