López Pérez, Óscar
Bolea Bailo, Rosa (dir.) ; Martín Burriel, Inmaculada (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2018
Resumen: Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), o enfermedades priónicas, son un grupo de trastornos neurodegenerativos fatales que afectan a los animales y al hombre, caracterizados por la acumulación de una isoforma infecciosa (PrPSc) de la proteína prion celular (PrPc) en el sistema nervioso central (SNC). Utilizando el scrapie ovino como modelo animal de EET, en la presente Tesis Doctoral hemos analizado la posible implicación de la autofagia, un proceso intracelular fundamental que evita la acumulación de orgánulos dañados y proteínas mal plegadas, en la neuropatología asociada a estas enfermedades. Mediante estudios de expresión génica y determinación inmunohistoquímica de algunos de los marcadores de autofagia más utilizados en la actualidad, evaluamos la regulación de este proceso en ovino infectado de forma natural con scrapie clásico, en ovejas inoculadas experimentalmente con scrapie atípico y en el modelo murino transgénico Tg338, el cual sobreexpresa el alelo del gen ovino de la proteína prion (PRNP) más susceptible al scrapie clásico (VRQ).
En estos modelos hemos identificado una disminución en los niveles de expresión de genes relacionados con la autofagia como ATG5 y un incremento del marcador p62, una proteína que se acumula en respuesta al deterioro degradativo autofágico, principalmente en las áreas del SNC más afectadas por la enfermedad. El análisis de las dos formas clínicas de scrapie, las cuales difieren en la distribución neuroanatómica tanto de las lesiones histopatólogicas como de los depósitos de PrPSc, nos ha permitido concluir, no sólo que la maquinaria autofágica se encuentra alterada durante el curso de la infección priónica, sino también que dicha alteración está relacionada con la neuropatología de la enfermedad y es en gran medida dependiente de las características lesionales particulares de la región del SNC analizada. Por otro lado, en la línea transgénica murina Tg338 hemos demostrado que la disfunción de la autofagia tiene lugar durante las fases tardías de la infección priónica. Aunque este modelo experimental muestra una regulación autofágica diferencial con respecto a ratones de tipo wild-type, probablemente debido a la sobreexpresión de la PrPc, en general, la línea murina Tg338 presenta una respuesta a la infección con scrapie clásico y una actividad autofágica similares a las observadas en el ovino, por lo que puede considerarse un método in vivo adecuado para estudiar la autofagia y las EETs de manera conjunta.
En la actualidad, el único diagnóstico efectivo de las enfermedades priónicas se basa en la detección directa de la PrPSc en el SNC de manera post-mortem o en tejidos y fluidos periféricos mediante técnicas de amplificación in vitro. La detección de la PrPSc no se considera fiable para el diagnóstico in vivo, y algunas de las técnicas de amplificación son costosas y requieren de laboratorios especializados. En esta Tesis Doctoral hemos realizado diversos estudios dirigidos a la identificación de biomarcadores distintos a la PrPSc y a la validación de potenciales biomarcadores génicos ya identificados para proporcionar alternativas útiles a la metodología diagnóstica actual.
Mediante RT-qPCR estudiamos la expresión de diez genes, cuya implicación en la propagación priónica había sido descrita previamente in vitro, en la médula oblongada de ovino con scrapie natural. De todos ellos, detectamos una regulación diferencial en BAMBI y CHGA, por lo que estos dos marcadores se analizaron posteriormente mediante inmunohistoquímica en el modelo ovino y en el modelo murino Tg338. Los cambios de expresión de estos genes tanto a nivel génico como proteico en ambos modelos de scrapie sugieren que podrían desempeñar un papel relevante en la neuropatología de las EETs in vivo, señalándolos a su vez como potenciales biomarcadores de la enfermedad. Además, las proteínas codificadas por BAMBI y CHGA muestran una relación, no sólo con la replicación del prion, sino también con la microgliosis reactiva asociada a estas enfermedades.
Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) circulantes han sido propuestos como potenciales biomarcadores en una amplia variedad de patologías, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. En esta Tesis Doctoral hemos analizado, en plasma sanguíneo y líquido cefalorraquídeo (LCR) de ovino con scrapie, una batería de miRNAs que han mostrado cambios de expresión en otros modelos de EET, demostrando por primera vez alteraciones en los niveles de varios miRNAs circulantes en una enfermedad priónica de origen natural. En los animales infectados con scrapie detectamos un incremento de miR-342-3p y miR-21-5p en plasma, y de miR-342-3p, miR-146a-5p, miR-128-3p y miR-21-5p en LCR, por lo que estas moléculas pueden ser candidatas adecuadas para ser utilizadas como nuevos biomarcadores de la enfermedad. A pesar de que también analizamos sus perfiles de expresión en la fracción exosomal de ambos fluidos biológicos con el fin de concentrar la señal de estos miRNAs y así poder proporcionar un método de diagnóstico más sensible, la purificación de exosomas no mejoró la señal de amplificación de estas moléculas, o al menos, de la batería de miRNAs seleccionada.
Finalmente, evaluamos la presencia de la PrPSc en exosomas circulantes mediante PMCA, ya que la circulación del prion a través del organismo podría estar facilitada por estas vesículas y, por tanto, podrían ser en parte responsables de la prionemia descrita en scrapie. En los exosomas aislados de plasma de ovino con scrapie no detectamos la presencia de la proteína patológica, por lo que la fracción exosomal de la sangre no parece estar implicada en la ruta hematógena de neuroinvasión en este hospedador, ni su análisis resulta adecuado para diagnosticar la enfermedad in vivo. Por el contrario, la detección de la PrPSc en los exosomas aislados de LCR podría representar un biomarcador útil para facilitar el diagnóstico in vivo de las EETs durante las últimas etapas de la enfermedad, ya que la amplificación de esta proteína fue positiva en la gran mayoría de muestras procedentes de animales en fase clínica.
Mediante un compendio de seis estudios, en esta Tesis Doctoral se ha analizado la implicación de la autofagia en las EETs y se ha profundizado en la validación de potenciales biomarcadores de estas enfermedades mediante el estudio de genes codificantes de proteínas, miRNAs y exosomas circulantes, cumpliendo los objetivos planteados al inicio de la misma.
Resumen (otro idioma):
En estos modelos hemos identificado una disminución en los niveles de expresión de genes relacionados con la autofagia como ATG5 y un incremento del marcador p62, una proteína que se acumula en respuesta al deterioro degradativo autofágico, principalmente en las áreas del SNC más afectadas por la enfermedad. El análisis de las dos formas clínicas de scrapie, las cuales difieren en la distribución neuroanatómica tanto de las lesiones histopatólogicas como de los depósitos de PrPSc, nos ha permitido concluir, no sólo que la maquinaria autofágica se encuentra alterada durante el curso de la infección priónica, sino también que dicha alteración está relacionada con la neuropatología de la enfermedad y es en gran medida dependiente de las características lesionales particulares de la región del SNC analizada. Por otro lado, en la línea transgénica murina Tg338 hemos demostrado que la disfunción de la autofagia tiene lugar durante las fases tardías de la infección priónica. Aunque este modelo experimental muestra una regulación autofágica diferencial con respecto a ratones de tipo wild-type, probablemente debido a la sobreexpresión de la PrPc, en general, la línea murina Tg338 presenta una respuesta a la infección con scrapie clásico y una actividad autofágica similares a las observadas en el ovino, por lo que puede considerarse un método in vivo adecuado para estudiar la autofagia y las EETs de manera conjunta.
En la actualidad, el único diagnóstico efectivo de las enfermedades priónicas se basa en la detección directa de la PrPSc en el SNC de manera post-mortem o en tejidos y fluidos periféricos mediante técnicas de amplificación in vitro. La detección de la PrPSc no se considera fiable para el diagnóstico in vivo, y algunas de las técnicas de amplificación son costosas y requieren de laboratorios especializados. En esta Tesis Doctoral hemos realizado diversos estudios dirigidos a la identificación de biomarcadores distintos a la PrPSc y a la validación de potenciales biomarcadores génicos ya identificados para proporcionar alternativas útiles a la metodología diagnóstica actual.
Mediante RT-qPCR estudiamos la expresión de diez genes, cuya implicación en la propagación priónica había sido descrita previamente in vitro, en la médula oblongada de ovino con scrapie natural. De todos ellos, detectamos una regulación diferencial en BAMBI y CHGA, por lo que estos dos marcadores se analizaron posteriormente mediante inmunohistoquímica en el modelo ovino y en el modelo murino Tg338. Los cambios de expresión de estos genes tanto a nivel génico como proteico en ambos modelos de scrapie sugieren que podrían desempeñar un papel relevante en la neuropatología de las EETs in vivo, señalándolos a su vez como potenciales biomarcadores de la enfermedad. Además, las proteínas codificadas por BAMBI y CHGA muestran una relación, no sólo con la replicación del prion, sino también con la microgliosis reactiva asociada a estas enfermedades.
Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) circulantes han sido propuestos como potenciales biomarcadores en una amplia variedad de patologías, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. En esta Tesis Doctoral hemos analizado, en plasma sanguíneo y líquido cefalorraquídeo (LCR) de ovino con scrapie, una batería de miRNAs que han mostrado cambios de expresión en otros modelos de EET, demostrando por primera vez alteraciones en los niveles de varios miRNAs circulantes en una enfermedad priónica de origen natural. En los animales infectados con scrapie detectamos un incremento de miR-342-3p y miR-21-5p en plasma, y de miR-342-3p, miR-146a-5p, miR-128-3p y miR-21-5p en LCR, por lo que estas moléculas pueden ser candidatas adecuadas para ser utilizadas como nuevos biomarcadores de la enfermedad. A pesar de que también analizamos sus perfiles de expresión en la fracción exosomal de ambos fluidos biológicos con el fin de concentrar la señal de estos miRNAs y así poder proporcionar un método de diagnóstico más sensible, la purificación de exosomas no mejoró la señal de amplificación de estas moléculas, o al menos, de la batería de miRNAs seleccionada.
Finalmente, evaluamos la presencia de la PrPSc en exosomas circulantes mediante PMCA, ya que la circulación del prion a través del organismo podría estar facilitada por estas vesículas y, por tanto, podrían ser en parte responsables de la prionemia descrita en scrapie. En los exosomas aislados de plasma de ovino con scrapie no detectamos la presencia de la proteína patológica, por lo que la fracción exosomal de la sangre no parece estar implicada en la ruta hematógena de neuroinvasión en este hospedador, ni su análisis resulta adecuado para diagnosticar la enfermedad in vivo. Por el contrario, la detección de la PrPSc en los exosomas aislados de LCR podría representar un biomarcador útil para facilitar el diagnóstico in vivo de las EETs durante las últimas etapas de la enfermedad, ya que la amplificación de esta proteína fue positiva en la gran mayoría de muestras procedentes de animales en fase clínica.
Mediante un compendio de seis estudios, en esta Tesis Doctoral se ha analizado la implicación de la autofagia en las EETs y se ha profundizado en la validación de potenciales biomarcadores de estas enfermedades mediante el estudio de genes codificantes de proteínas, miRNAs y exosomas circulantes, cumpliendo los objetivos planteados al inicio de la misma.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: genetica veterinaria
Titulación: Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas
Plan(es): Plan 495
Departamento: Farmacología y Fisiología
Nota: Presentado: 17 12 2018
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Farmacología y Fisiología, 2018
Todos los derechos reservados
Enlace permanente:
Registro creado el 2021-02-04, última modificación el 2021-05-20
