Vela Román, Eduardo
Hernández Orte, Purificación (dir.) ; Ferreira González, Vicente (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2018
Resumen: Los objetivos de esta tesis son estudio de la acción de diversos procesos tecnológicos sobre el H2S y diversos mercaptanos de importancia aromática en el vino, mejorar nuestra comprensión acerca del problema de reducción y en general, acerca del estado químico de dichas moléculas.
Se han abordado los siguientes objetivos específicos:
- Estudiar el efecto en la composición de mercaptanos polifuncionales de los vinos de la variedad Sauvignon blanc tras la clarificación con bentonita en diferentes estadios de la fermentación alcohólica.
- Comparar y evaluar la eficacia a corto y largo plazo de los tratamientos con cobre y productos enológicos que contienen cobre, sobre los compuestos causantes del problema de reducción de los vinos.
- Estudiar el efecto de la dosis y el tiempo de micro-oxigenación de los vinos en los compuestos que contienen azufre (H2S, MeSH, DMS y EtSH) así como en la capacidad del vino para liberar y formar estos compuestos una vez ha terminado la MOX.
- Desarrollar un modelo relacionando las especies químicas bajo las que se encuentran el H2S y los mercaptanos con los principales equilibrios, redox y de formación de complejos con metales del vino.
- Caracterizar el problema de reducción, haciendo un screening de las concentraciones de VSCs antes y después de envejecimiento anóxico, en vinos de diferentes orígenes y estados.
- Desarrollar un nuevo método de análisis para la determinación realista de los VSCs libres, incluyendo SO2 libre real, y de sus formas complejas con metales mediante cromatografía gaseosa y detección de quimioluminiscencia de azufre.
- Evaluación preliminar sobre los papeles del cobre y el azufre micronizado en los tratamientos en el viñedo y en el envejecimiento del vino con lías de levaduras, en los niveles de VSCs.
Todos los trabajos integrados en esta tesis, comprenden estudios sobre los principales compuestos que contienen azufre presentes en los vinos. De los ocho trabajos presentados en la tesis, siete de ellos tratan sobre los compuestos azufrados de bajo peso molecular con implicación en el problema de reducción de los vinos. El otro trabajo se centra en los mercaptanos polifuncionales, compuestos que contienen azufre y son clave en el aroma muchos vinos blancos.
1. Efecto del uso de bentonita en los mercaptanos polifuncionales y otros compuestos volátiles en vinos de la variedad Sauvignon blanc [9]
Artículo publicado en American Journal of Enology and Viticulture, 68 (2017) 30-38
El uso de la bentonita en bodega es muy común debido a su capacidad para clarificar los vinos, en especial, para eliminar las proteínas en los vinos blancos. Los enólogos saben que este producto enológico no solo tiene efectos sobre las proteínas que se quieren eliminar, sino también sobre compuestos aromáticos importantes de los vinos. En este trabajo se ha estudiado el efecto de la dosis, el tiempo de tratamiento y el momento más adecuado para adicionar la bentonita sobre más de 60 compuestos volátiles. Concretamente, se ha estudiado la influencia de la clarificación con bentonita adicionada en dos momentos, al comienzo y tras acabar la fermentación alcohólica en mostos y vinos de la variedad Sauvignon blanc en dos añadas y en distintas dosis. Se ha encontrado que cuando el tratamiento con bentonita se realiza en el vino son necesarias dosis menores que cuando se añade al mosto. Se analizaron parámetros enológicos clásicos y sesenta compuestos volátiles, incluidos los tioles varietales. Los resultados mostraron que el efecto de la bentonita sobre los parámetros clásicos fue mínimo tanto en el tratamiento durante la fermentación como en el vino final. Se encontraron diferencias significativas en los compuestos volátiles finales encontrados en los vinos dependiendo del momento en el que se adiciona la bentonita y de la añada de los vinos usados. Finalmente, la adición de bentonita disminuye significativamente la concentración de mercaptanos polifuncionales, especialmente si la adición se realiza al principio la fermentación. Este estudio sugiere que la clarificación con bentonita puede disminuir el carácter varietal de los vinos de Sauvignon Blanc debido a su impacto sobre los mercaptanos polifuncionales.
2. Efectos de la clarificación de vinos con cobre sobre el contenido de compuestos que contienen azufre y en su evolución durante el almacenamiento anóxico acelerado [10]
Artículo publicado en Food Chemistry, 231 (2017) 212-221.
El uso del cobre para eliminar los olores desagradables que contienen algunos vinos, sigue siendo una técnica habitual en bodega. Los enólogos saben que la adición de pequeñas cantidades de cobre produce una mejora organoléptica de los vinos. Su efecto se debe a que el cobre reacciona con los compuestos que contienen azufre formando complejos no volátiles, si bien la mayor parte de los enólogos dan por supuesto que hay una precipitación que elimina las moléculas causantes del olor. En este trabajo se realizó un ensayo con tres vinos diferentes con problemas de reducción. A los tres vinos se les adicionaron dos dosis diferentes de cobre añadido como sulfato de cobre y tratamiento con un producto enológico que contenía cobre. Una semana después del tratamiento los vinos se centrifugaron y se analizaron los VSCs libres y los BR-VSCs. Además, una alícuota de cada una de las muestras fue sometida a envejecimiento acelerado anóxico. El efecto de la adición de cobre sobre los niveles libres de H2S y MeSH fue inmediato, en ambos casos disminuyó su concentración. Además, en los vinos tratados con cobre se reduce la velocidad de liberación de H2S tras las dos primeras semanas de envejecimiento acelerado respecto al control, pero a las 7 semanas los niveles de H2S y MeSH fueron iguales o superiores a los del control. En algunas muestras, que habían sido previamente micro-oxigenadas en bodega, la concentración del H2S-BR (formas libres más acomplejadas con metales) aumentó significativamente tras el envejecimiento anóxico, lo que sugiere que en esos vinos había formas de H2S no detectables por el método de dilución de salmuera. Además, tras el envejecimiento acelerado en algunos vinos tratados con cobre se observaron mayores concentraciones de BR-H2S, lo que sugiere que el cobre puede inducir la acumulación de BR-H2S por posible degradación catalítica de moléculas conteniendo S (cisteína).
3. La microoxigenación no elimina el sulfuro de hidrógeno y los mercaptanos del vino; simplemente cambia los equilibrios redox y complejos a especies reversibles oxidables y formas complejas [6]
Artículo publicado en Food Chemistry, 243 (2018) 222-230.
La micro-oxigenación es un proceso que dosifica al vino pequeñas cantidades de oxígeno, con el objetivo de mejorar las características organolépticas del mismo. Este proceso genera cambios aromáticos en los vinos, produciendo cambios en varias familias aromáticas incluidos los compuestos azufrados. Debido a la alta volatilidad y reactividad de estos compuestos con el oxígeno tradicionalmente se ha pensado que estos compuestos desaparecían después del tratamiento fundamentalmente por oxidación y una parte menor por evaporación. En la bibliografía se confirman que el H2S y los mercaptanos son altamente reactivos frente a las quinonas generadas durante la oxidación del vino. Sin embargo, el hallazgo de que muestras previamente micro-oxigenadas tienen pequeños niveles iniciales de BR-H2S, pero aumentan fuertemente tras la reducción, cuestiona dicha presunción. Por esta razón, se propuso un ensayo para evaluar el efecto de la micro-oxigenación en tres vinos con problemas de reducción. Se probaron tres dosis diferentes de oxígeno (4,5 mg/L administrados en 95 días, 7,8 mg/L administrados en 29 días y 19,5 mg/L administrados en 95 días). Tras finalizar el tratamiento los vinos se almacenaron entre 1 y 6 semanas en anoxia hasta que los niveles de O2 fueron muy bajos, y luego se analizaron los VSCs tanto libres como BR, potencial redox y una pequeña alícuota de la muestra se sometió a envejecimiento acelerado de dos y siete semanas y, posteriormente, se analizaron de nuevo el potencial redox y los VSC libres y BR. La micro-oxigenación produjo una significativa disminución de la concentración de H2S y MeSH libres, así como del BR-H2S. Sin embargo, tras el envejecimiento acelerado se observó que las muestras MOX tenían una capacidad similar para liberar VSCs a las no MOX. Incluso, los niveles de VSCs BR de las muestras MOX fueron en la mayoría de los casos similares o superiores a los controles no oxigenados. Cuando se representaron los niveles de formas BR de VSCs de todas las muestras producidas a partir del mismo vino frente al potencial redox de las muestras, reveló que a potenciales redox negativos, los niveles de las formas BR son máximos y que disminuyen a raíz de una tendencia sigmoidea para acercarse a 0 a potenciales positivos. El potencial redox del punto central del sigmoide dependía del vino y estaba entre -50 y -90 mV (frente a Ag / AgCl (s)). También se observó una tendencia similar para la fracción de formas libres (libre/BR). Estos resultados revelan que MOX induce cambios reversibles que afectan los niveles de BR y la fracción de formas libres (libre/BR), y que esos cambios están fuertemente relacionados con el potencial redox del vino. Esto sugiere que todos los cambios deben ser el resultado de equilibrios reversibles entre formas de VSCs libres, con complejos metálicos y oxidadas.
4. Química del sulfuro de hidrógeno y mercaptanos en el vino [11]
Artículo publicado en Journal of Agricultural and Food Chemistry, 66 (2018) 2237-2246.
Este trabajo resume, discute y complementa los hallazgos recientes sobre el destino del H2S y el metanotiol durante el almacenamiento del vino. Los aspectos más importantes del trabajo se detallan a continuación:
El vino contiene una cantidad de H2S y MeSH, distribuido en diferentes especies. Esta cantidad puede llegar a aumentar si se dan las condiciones para que se produzca la desulfuración de los aminoácidos cisteína y metionina catalizada por metales. Estas condiciones parecen ser bastante infrecuentes en el caso de H2S en vinos tintos, pero son más frecuentes en blancos y ocurren normalmente para el MeSH. Las cantidades totales de H2S y MeSH, se distribuyen entre formas libres, formas complejas (libres más complejas = formas BR) y formas oxidadas interconectadas a través de equilibrios de formación de complejos y redox, probablemente interconectados por la reducción/oxidación natural de los mercaptanos mayoritarios del vino (glutatión y cisteína).
Las formas BR se componen de formas libres (olor activo) y formas acomplejadas con metales, principalmente Cu (II), Cu (I), Fe (II) e incluso Zn (II). La fuerza de los complejos disminuye en el orden Cu (II)> Cu (I)> Fe (II)> Zn (II) y es mayor para H2S que para el MeSH. La formación de formas oxidadas parece que tiene lugar a través de los complejos de cobre, que actuaría como catalizador. Los equilibrios químicos entre las diferentes especies vendrán definidos por el potencial redox del vino. El potencial redox del vino depende de los pares redox presentes en el vino y más activos en el electrodo. Estos pares serían el Fe(III)/Fe(II) a potenciales por encima de 100 mV (frente a Ag/AgCl) y el GSH/GSSH o la cisteína/cistina a potenciales negativos, tal y como se comprobó con disoluciones modelo.
Dado que el potencial redox del vino depende de su exposición al oxígeno, éste juega un papel esencial en la química de los compuestos con funcionalidad tiol que se encuentran en el vino. La oxidación parece ser capaz de transformar prácticamente la totalidad de los mercaptanos en disulfuros y polisulfuros no volátiles a través de una reacción reversible. Probablemente, los primeros en oxidarse son los mercaptanos mayoritarios del vino (GSH y cisteína). Al hacerlo, dejan libres los núcleos metálicos con los que estaban acomplejados, provocando un aumento de la fracción acomplejada de H2S y MeSH y por tanto una disminución de formas libres. Tras los mercaptanos mayoritarios, pasarán a oxidarse H2S, MeSH y otros pequeños mercaptanos, que formarán en su mayor parte disulfuros y polisulfuros mixtos con los mercaptanos mayoritarios, por lo que dejarán de ser detectados en nuestros análisis. Ahora bien, dado que por razones no bien conocidas el potencial redox del vino baja de manera espontánea al ser almacenado en anoxia, el proceso se revierte, de manera que en función del potencial redox al que se encuentre el vino, tendremos una determinada distribución de formas oxidadas, complejas y libres, tanto más enriquecida en estas últimas cuanto más negativo se vuelva el potencial. El problema de reducción aparecerá, por tanto, en todos aquellos vinos que tengan contenidos de H2S, MeSH y otros pequeños mercaptanos en cantidades suficientemente altas como para que la fracción libre a potenciales redox negativos supere claramente los valores umbral. Este modelo, también soporta la importancia de la permeabilidad del oxígeno del tapón, ya que determina el potencial redox del vino almacenado en la botella.
5. Caracterización de los vinos españoles en base al problema de la reducción
Artículo en preparación (destinado a ser enviado al American J. Enol. Vitic.)
Ante la variedad de comportamientos que se han encontrado a lo largo de la tesis, se decidió hacer un screening de varios vinos de diferentes variedades y regiones, una buena parte de ellos afectados por problemas de reducción a juicio de sus enólogos, con el fin de poder evaluar las dimensiones y variabilidad del problema de reducción. A todos los vinos se les aplicó la misma metodología para tener el mayor número posible de muestras comparables: en todas las muestras nada más llegar al laboratorio se analizaron los VSCs libres y BRs, el potencial redox y los principales metales; los vinos fueron además sometidos a un proceso de envejecimiento acelerado de al menos 2 semanas, tras el cual se repitieron los análisis de los VSCs y de potencial redox. Los resultados demostraron que, salvo un vino recién fermentado y con contenidos ya muy altos de formas libres, todos los vinos liberan formas libres de H2S y de MeSH cuando son sometidos a un envejecimiento acelerado. La pendiente de liberación de estos compuestos es muy variable y dependiente del vino, de manera que los niveles finales alcanzados variaron en el rango 3-135 µg/L para el H2S y entre 1 y 15 µg/L para el MeSH. Prácticamente la totalidad de los vinos considerados potencialmente problemáticos por sus enólogos, tuvieron cantidades de BR-H2S tras envejecimiento acelerado superiores a 80 µg/L, mientras que los vinos embotellados generalmente tienen niveles por debajo de 50 µg/L. Como se había observado previamente, el máximo de concentración de BR-H2S se observa entre el inicio y las dos semanas de envejecimiento acelerado, lo que confirma que este tiempo es suficiente para generar el máximo nivel. Cerca de la mitad de los casos tuvieron niveles de Br-H2S máximos antes del envejecimiento acelerado, tal y como se había observado previamente con vinos comerciales embotellados, lo que sugiere que la formación “de novo” de H2S a partir de degradaciones catalíticas de metales, tiene lugar en un número limitado de vinos. Por el contrario, la concentración de MeSH BR no dejó de aumentar durante el envejecimiento acelerado en prácticamente todos los vinos, por lo que se puede concluir que, además del pequeño pool formado en fermentación, la fuente de este compuesto es la desulfuración del aminoácido metionina y mientras se den las condiciones adecuadas, no dejará de aumentar. El EtSH, que sólo se pudo detectar en un número limitado de muestras y en bajas concentraciones, no mostró acumulación, lo que sugiere que su formación es exclusivamente fermentativa.
6. Método de cromatografía de gases con detección de quimioluminiscencia para la determinación de manera simultánea de formas libres de compuestos volátiles (VSCs) y dióxido de azufre y para la determinación de formas acomplejadas con metales de VSCs.
Artículo enviado a J. Chromatogr. A
En este trabajo, se han desarrollado tres procedimientos diferentes para la evaluación cuantitativa de formas libres de los VSCs más importantes en el problema de reducción de los vinos junto con el SO2 libre real. Esto se ha conseguido al emplear un sistema totalmente inerte, una columna SPB-1 Sulfur, un sistema de criofocalización con nitrógeno líquido y un detector SCD, que permite que el SO2 se eluya dando un pico perfectamente gaussiano y no saturado, de manera que ha dejado de ser una interferencia y ha podido ser cuantificado. La mayor sensibilidad conseguida, permite obtener una señal claramente mensurable del etanotiol, dietilsulfuro, tioacetato de etilo y metilo, sulfuro de carbono.
La parte de optimización más delicada fue la inyección, en la que fue preciso optimizar las condiciones de criofocalización, la precolumna empleada, el volumen de inyección, la relación de Split y la velocidad de introducción de la muestra. Las mejores condiciones se consiguieron inyectando 1 mL de espacio de cabeza de un vial de 20 mL conteniendo 12 mL de muestra a una velocidad de 30 µL/s, con un split 1:2 y manteniendo el criotrap a una temperatura de -150 ºC para focalizar la muestra durante 0,8 min sobre una precolumna polar.
Los límites de detección del método desarrollado están por debajo de los umbrales de olfacción de los compuestos medidos, siendo inferior a 0,1 ppb para H2S, MeSH, EtSH y DMS. La repetibilidad, medida en vinos reales, es excelente, siendo en casi todos los casos menor del 10% para todos los compuestos y la linealidad del método es aceptable al cubrir el rango de aparición de estos compuestos en vino.
El método de análisis de formas libres se complementó con una nueva metodología para medir formas BRs. Gracias a la sensibilidad del sistema, se pudo reemplazar la preconcentración en fibra SPME empleada anteriormente, por una inyección del espacio de cabeza en equilibrio sobre la muestra diluida con salmuera a 70ºC durante 25 minutos. Pudimos constatar que la dilución con salmuera es estrictamente necesaria para conseguir romper los complejos tanto de cobre como de cinc, y que una dilución 1/10 representa la mejor solución de compromiso.
Los parámetros de validación de este método son también aceptables. La repetibilidad, medida como % DSR, es menor del 10% en prácticamente todos los casos. La linealidad es suficiente para cubrir el rango de aparición de estos compuestos en vino y los límites de detección son satisfactorios, oscilan desde 0,06 µg/L para el H2S hasta 1,35 µg/L para el DMS.
7. Efectos de los tratamientos con productos fitosanitarios de azufre y sulfato de cobre en uvas sobre la generación de problemas de reducción en vino
Artículo en preparación
Los vinos en los cuales las uvas se trataron con sulfato de cobre no se encontraron diferencias significativas respecto del control ni para H2S libre ni BR ni MeSH, contra lo esperado. Aparentemente, el cobre se perdió rápidamente de la masa de fermentación debido a la probable adsorción en las partes sólidas. Aunque los vinos tenían una concentración de cobre significativamente mayor que el control y el vino procedente de uvas tratadas con azufre, esta concentración estaba dentro del rango "normal" (57 contra 20 µg/L). También se encontraron diferencias significativas para la absorbancia a 520 nm y los niveles de β-damascenona en vinos de uvas tratadas con cobre.
Por el contrario, la presencia de azufre en las uvas tuvo un impacto drástico en los niveles de H2S y MeSH de los vinos. Los niveles de H2S libre fueron 19 µg /L, 7 veces por encima del control. Los niveles de MeSH libre fueron 3,8 µg/L, más de 4 veces por encima del control. Los niveles de formas BR también fueron mucho más altos que los de los controles en ambos casos, y las diferencias se mantuvieron después del envejecimiento acelerado en anoxia.
8. Estudio preliminar del efecto de las lías de levadura en el contenido de VSCs de los vinos que sufren problemas de reducción
Artículo en preparación (Estos resultados son preliminares y se complementarán con investigaciones adicionales).
Los tratamientos llevados a cabo con lías obtenidas del ensayo 3.7. fueron aparentemente extremadamente efectivos para reducir los niveles de H2S y MeSH tanto de libres como de acomplejados con metales. De los tres tipos de lías usadas (control, uvas tratadas con cobre y uvas tratadas con azufre) todas se comportan de manera similar, lo que sugiere que la historia previa del vino a partir de la cual se obtienen las lías tiene una influencia marginal en la eficiencia del tratamiento. Los niveles de H2S libre después del envejecimiento reductor se redujeron drásticamente en los cuatro vinos tratados (de 19 a 5,8; de 15 a 4,0; de 22 a 3,4 y de 30 a 7,3 µg/L). Los niveles de BR H2S tras el envejecimiento acelerado se redujeron de manera similar (de 120 a 40; de 70 a 14,2; de 130 a 16 o de 108 a 40 µg/L). La reducción de MeSH libre también fue clara (de 3,7 a 0,8; de 2 a 0,5; de 2,4 a 0,45; o de 5 a 1,25 µg/L). Incluso los niveles de DMS se redujeron significativamente (de 55 a 35; de 30 a 18; de 38 a 23; o de 22 a 13 µg/L).
CONCLUSIONES
• El tratamiento con bentonita disminuye la calidad organoléptica de los vinos debido a su impacto sobre los tioles varietales. Este efecto es mayor si el tratamiento se realiza al principio de la fermentación alcohólica que cuando se realiza en vino acabado.
• Los tratamientos con cobre tienen un efecto inmediato en la diminución de los niveles de H2S y MeSH. Sin embargo, dicha disminución es reversible cuando el vino es almacenado en anoxia. Los niveles de H2S libre aumentar más lentamente en muestras tratadas con cobre respecto de muestras con niveles más pequeños, aunque los niveles finales convergen. Los efectos sobre los niveles de MeSH a largo plazo son marginales. Se puede decir que los tratamientos con cobre retrasan el problema de reducción, pero no lo resuelven.
• Adicionalmente, se ha demostrado que altas dosis de cobre, pueden inducir la acumulación de niveles más altos de BR-H2S, lo que podría deberse a procesos de degradación catalítica de aminoácidos azufrados.
• La MOX también genera una diminución reversible de los niveles de H2S y MeSH tanto libres como BR. Sin embargo, los niveles se recuperan cuantitativamente cuando el vino es almacenado en anoxia. Tanto los BR-H2S como la ratio libre/BR H2S siguen una tendencia sigmoidea cuando se representan frente al potencial redox. Esto demuestra que la oxidación lenta que produce la micro-oxigenación no elimina el H2S ni los mercaptanos. Aunque sí genera un desplazamiento del equilibrio de libre a acomplejado con metales y finalmente a formas oxidadas.
• Todo esto sugiere que cada vino contiene una cantidad definida de "H2S total" presente bajo tres tipos de especies: libre, complejas y oxidadas. Dichas formas están interconectadas a través de equilibrios de formación de complejos y redox reversibles. La distribución entre especies depende del potencial redox del vino. A potenciales altos, dominan las formas oxidadas, mientras que a potenciales negativos lo hacen las formas reducidas (libres y complejas)
• El MeSH, aunque está también sometido a los mismos equilibrios, sus niveles aumentan de manera continua durante el envejecimiento por desulfuración catalizada por metales de metionina.
• Se ha determinado los rangos de concentraciones de las formas libres, BRs y totales (medidas tras envejecimiento acelerado) de un amplio conjunto de vinos, demostrándose que existe una gran variabilidad entre vinos en cuanto a su capacidad para acumular H2S y MeSH durante el envejecimiento anóxico.
• Basado en un sistema HS-criotrapping-GC-SCD, se ha conseguido un sistema analítico capaz de cuantificar de manera muy sensible y repetitiva los VSCs libres junto con el SO2 libre real. De manera complementaria, se ha desarrollado un segundo método basado en el análisis del espacio de cabeza sobre el vino diluido con salmuera y una incubación de 25 min a 70 ºC, para la determinación de las formas BRs.
• La presencia de sales de cobre (II) en las uvas no influye en la incidencia del problema de reducción de los vinos. Por el contrario, la presencia de azufre, tiene un impacto drástico en este problema.
• El trabajo preliminar con lías ha demostrado que los tratamientos con lías finas son muy efectivos para reducir los problemas de reducción de los vinos.
Resumen (otro idioma):
Se han abordado los siguientes objetivos específicos:
- Estudiar el efecto en la composición de mercaptanos polifuncionales de los vinos de la variedad Sauvignon blanc tras la clarificación con bentonita en diferentes estadios de la fermentación alcohólica.
- Comparar y evaluar la eficacia a corto y largo plazo de los tratamientos con cobre y productos enológicos que contienen cobre, sobre los compuestos causantes del problema de reducción de los vinos.
- Estudiar el efecto de la dosis y el tiempo de micro-oxigenación de los vinos en los compuestos que contienen azufre (H2S, MeSH, DMS y EtSH) así como en la capacidad del vino para liberar y formar estos compuestos una vez ha terminado la MOX.
- Desarrollar un modelo relacionando las especies químicas bajo las que se encuentran el H2S y los mercaptanos con los principales equilibrios, redox y de formación de complejos con metales del vino.
- Caracterizar el problema de reducción, haciendo un screening de las concentraciones de VSCs antes y después de envejecimiento anóxico, en vinos de diferentes orígenes y estados.
- Desarrollar un nuevo método de análisis para la determinación realista de los VSCs libres, incluyendo SO2 libre real, y de sus formas complejas con metales mediante cromatografía gaseosa y detección de quimioluminiscencia de azufre.
- Evaluación preliminar sobre los papeles del cobre y el azufre micronizado en los tratamientos en el viñedo y en el envejecimiento del vino con lías de levaduras, en los niveles de VSCs.
Todos los trabajos integrados en esta tesis, comprenden estudios sobre los principales compuestos que contienen azufre presentes en los vinos. De los ocho trabajos presentados en la tesis, siete de ellos tratan sobre los compuestos azufrados de bajo peso molecular con implicación en el problema de reducción de los vinos. El otro trabajo se centra en los mercaptanos polifuncionales, compuestos que contienen azufre y son clave en el aroma muchos vinos blancos.
1. Efecto del uso de bentonita en los mercaptanos polifuncionales y otros compuestos volátiles en vinos de la variedad Sauvignon blanc [9]
Artículo publicado en American Journal of Enology and Viticulture, 68 (2017) 30-38
El uso de la bentonita en bodega es muy común debido a su capacidad para clarificar los vinos, en especial, para eliminar las proteínas en los vinos blancos. Los enólogos saben que este producto enológico no solo tiene efectos sobre las proteínas que se quieren eliminar, sino también sobre compuestos aromáticos importantes de los vinos. En este trabajo se ha estudiado el efecto de la dosis, el tiempo de tratamiento y el momento más adecuado para adicionar la bentonita sobre más de 60 compuestos volátiles. Concretamente, se ha estudiado la influencia de la clarificación con bentonita adicionada en dos momentos, al comienzo y tras acabar la fermentación alcohólica en mostos y vinos de la variedad Sauvignon blanc en dos añadas y en distintas dosis. Se ha encontrado que cuando el tratamiento con bentonita se realiza en el vino son necesarias dosis menores que cuando se añade al mosto. Se analizaron parámetros enológicos clásicos y sesenta compuestos volátiles, incluidos los tioles varietales. Los resultados mostraron que el efecto de la bentonita sobre los parámetros clásicos fue mínimo tanto en el tratamiento durante la fermentación como en el vino final. Se encontraron diferencias significativas en los compuestos volátiles finales encontrados en los vinos dependiendo del momento en el que se adiciona la bentonita y de la añada de los vinos usados. Finalmente, la adición de bentonita disminuye significativamente la concentración de mercaptanos polifuncionales, especialmente si la adición se realiza al principio la fermentación. Este estudio sugiere que la clarificación con bentonita puede disminuir el carácter varietal de los vinos de Sauvignon Blanc debido a su impacto sobre los mercaptanos polifuncionales.
2. Efectos de la clarificación de vinos con cobre sobre el contenido de compuestos que contienen azufre y en su evolución durante el almacenamiento anóxico acelerado [10]
Artículo publicado en Food Chemistry, 231 (2017) 212-221.
El uso del cobre para eliminar los olores desagradables que contienen algunos vinos, sigue siendo una técnica habitual en bodega. Los enólogos saben que la adición de pequeñas cantidades de cobre produce una mejora organoléptica de los vinos. Su efecto se debe a que el cobre reacciona con los compuestos que contienen azufre formando complejos no volátiles, si bien la mayor parte de los enólogos dan por supuesto que hay una precipitación que elimina las moléculas causantes del olor. En este trabajo se realizó un ensayo con tres vinos diferentes con problemas de reducción. A los tres vinos se les adicionaron dos dosis diferentes de cobre añadido como sulfato de cobre y tratamiento con un producto enológico que contenía cobre. Una semana después del tratamiento los vinos se centrifugaron y se analizaron los VSCs libres y los BR-VSCs. Además, una alícuota de cada una de las muestras fue sometida a envejecimiento acelerado anóxico. El efecto de la adición de cobre sobre los niveles libres de H2S y MeSH fue inmediato, en ambos casos disminuyó su concentración. Además, en los vinos tratados con cobre se reduce la velocidad de liberación de H2S tras las dos primeras semanas de envejecimiento acelerado respecto al control, pero a las 7 semanas los niveles de H2S y MeSH fueron iguales o superiores a los del control. En algunas muestras, que habían sido previamente micro-oxigenadas en bodega, la concentración del H2S-BR (formas libres más acomplejadas con metales) aumentó significativamente tras el envejecimiento anóxico, lo que sugiere que en esos vinos había formas de H2S no detectables por el método de dilución de salmuera. Además, tras el envejecimiento acelerado en algunos vinos tratados con cobre se observaron mayores concentraciones de BR-H2S, lo que sugiere que el cobre puede inducir la acumulación de BR-H2S por posible degradación catalítica de moléculas conteniendo S (cisteína).
3. La microoxigenación no elimina el sulfuro de hidrógeno y los mercaptanos del vino; simplemente cambia los equilibrios redox y complejos a especies reversibles oxidables y formas complejas [6]
Artículo publicado en Food Chemistry, 243 (2018) 222-230.
La micro-oxigenación es un proceso que dosifica al vino pequeñas cantidades de oxígeno, con el objetivo de mejorar las características organolépticas del mismo. Este proceso genera cambios aromáticos en los vinos, produciendo cambios en varias familias aromáticas incluidos los compuestos azufrados. Debido a la alta volatilidad y reactividad de estos compuestos con el oxígeno tradicionalmente se ha pensado que estos compuestos desaparecían después del tratamiento fundamentalmente por oxidación y una parte menor por evaporación. En la bibliografía se confirman que el H2S y los mercaptanos son altamente reactivos frente a las quinonas generadas durante la oxidación del vino. Sin embargo, el hallazgo de que muestras previamente micro-oxigenadas tienen pequeños niveles iniciales de BR-H2S, pero aumentan fuertemente tras la reducción, cuestiona dicha presunción. Por esta razón, se propuso un ensayo para evaluar el efecto de la micro-oxigenación en tres vinos con problemas de reducción. Se probaron tres dosis diferentes de oxígeno (4,5 mg/L administrados en 95 días, 7,8 mg/L administrados en 29 días y 19,5 mg/L administrados en 95 días). Tras finalizar el tratamiento los vinos se almacenaron entre 1 y 6 semanas en anoxia hasta que los niveles de O2 fueron muy bajos, y luego se analizaron los VSCs tanto libres como BR, potencial redox y una pequeña alícuota de la muestra se sometió a envejecimiento acelerado de dos y siete semanas y, posteriormente, se analizaron de nuevo el potencial redox y los VSC libres y BR. La micro-oxigenación produjo una significativa disminución de la concentración de H2S y MeSH libres, así como del BR-H2S. Sin embargo, tras el envejecimiento acelerado se observó que las muestras MOX tenían una capacidad similar para liberar VSCs a las no MOX. Incluso, los niveles de VSCs BR de las muestras MOX fueron en la mayoría de los casos similares o superiores a los controles no oxigenados. Cuando se representaron los niveles de formas BR de VSCs de todas las muestras producidas a partir del mismo vino frente al potencial redox de las muestras, reveló que a potenciales redox negativos, los niveles de las formas BR son máximos y que disminuyen a raíz de una tendencia sigmoidea para acercarse a 0 a potenciales positivos. El potencial redox del punto central del sigmoide dependía del vino y estaba entre -50 y -90 mV (frente a Ag / AgCl (s)). También se observó una tendencia similar para la fracción de formas libres (libre/BR). Estos resultados revelan que MOX induce cambios reversibles que afectan los niveles de BR y la fracción de formas libres (libre/BR), y que esos cambios están fuertemente relacionados con el potencial redox del vino. Esto sugiere que todos los cambios deben ser el resultado de equilibrios reversibles entre formas de VSCs libres, con complejos metálicos y oxidadas.
4. Química del sulfuro de hidrógeno y mercaptanos en el vino [11]
Artículo publicado en Journal of Agricultural and Food Chemistry, 66 (2018) 2237-2246.
Este trabajo resume, discute y complementa los hallazgos recientes sobre el destino del H2S y el metanotiol durante el almacenamiento del vino. Los aspectos más importantes del trabajo se detallan a continuación:
El vino contiene una cantidad de H2S y MeSH, distribuido en diferentes especies. Esta cantidad puede llegar a aumentar si se dan las condiciones para que se produzca la desulfuración de los aminoácidos cisteína y metionina catalizada por metales. Estas condiciones parecen ser bastante infrecuentes en el caso de H2S en vinos tintos, pero son más frecuentes en blancos y ocurren normalmente para el MeSH. Las cantidades totales de H2S y MeSH, se distribuyen entre formas libres, formas complejas (libres más complejas = formas BR) y formas oxidadas interconectadas a través de equilibrios de formación de complejos y redox, probablemente interconectados por la reducción/oxidación natural de los mercaptanos mayoritarios del vino (glutatión y cisteína).
Las formas BR se componen de formas libres (olor activo) y formas acomplejadas con metales, principalmente Cu (II), Cu (I), Fe (II) e incluso Zn (II). La fuerza de los complejos disminuye en el orden Cu (II)> Cu (I)> Fe (II)> Zn (II) y es mayor para H2S que para el MeSH. La formación de formas oxidadas parece que tiene lugar a través de los complejos de cobre, que actuaría como catalizador. Los equilibrios químicos entre las diferentes especies vendrán definidos por el potencial redox del vino. El potencial redox del vino depende de los pares redox presentes en el vino y más activos en el electrodo. Estos pares serían el Fe(III)/Fe(II) a potenciales por encima de 100 mV (frente a Ag/AgCl) y el GSH/GSSH o la cisteína/cistina a potenciales negativos, tal y como se comprobó con disoluciones modelo.
Dado que el potencial redox del vino depende de su exposición al oxígeno, éste juega un papel esencial en la química de los compuestos con funcionalidad tiol que se encuentran en el vino. La oxidación parece ser capaz de transformar prácticamente la totalidad de los mercaptanos en disulfuros y polisulfuros no volátiles a través de una reacción reversible. Probablemente, los primeros en oxidarse son los mercaptanos mayoritarios del vino (GSH y cisteína). Al hacerlo, dejan libres los núcleos metálicos con los que estaban acomplejados, provocando un aumento de la fracción acomplejada de H2S y MeSH y por tanto una disminución de formas libres. Tras los mercaptanos mayoritarios, pasarán a oxidarse H2S, MeSH y otros pequeños mercaptanos, que formarán en su mayor parte disulfuros y polisulfuros mixtos con los mercaptanos mayoritarios, por lo que dejarán de ser detectados en nuestros análisis. Ahora bien, dado que por razones no bien conocidas el potencial redox del vino baja de manera espontánea al ser almacenado en anoxia, el proceso se revierte, de manera que en función del potencial redox al que se encuentre el vino, tendremos una determinada distribución de formas oxidadas, complejas y libres, tanto más enriquecida en estas últimas cuanto más negativo se vuelva el potencial. El problema de reducción aparecerá, por tanto, en todos aquellos vinos que tengan contenidos de H2S, MeSH y otros pequeños mercaptanos en cantidades suficientemente altas como para que la fracción libre a potenciales redox negativos supere claramente los valores umbral. Este modelo, también soporta la importancia de la permeabilidad del oxígeno del tapón, ya que determina el potencial redox del vino almacenado en la botella.
5. Caracterización de los vinos españoles en base al problema de la reducción
Artículo en preparación (destinado a ser enviado al American J. Enol. Vitic.)
Ante la variedad de comportamientos que se han encontrado a lo largo de la tesis, se decidió hacer un screening de varios vinos de diferentes variedades y regiones, una buena parte de ellos afectados por problemas de reducción a juicio de sus enólogos, con el fin de poder evaluar las dimensiones y variabilidad del problema de reducción. A todos los vinos se les aplicó la misma metodología para tener el mayor número posible de muestras comparables: en todas las muestras nada más llegar al laboratorio se analizaron los VSCs libres y BRs, el potencial redox y los principales metales; los vinos fueron además sometidos a un proceso de envejecimiento acelerado de al menos 2 semanas, tras el cual se repitieron los análisis de los VSCs y de potencial redox. Los resultados demostraron que, salvo un vino recién fermentado y con contenidos ya muy altos de formas libres, todos los vinos liberan formas libres de H2S y de MeSH cuando son sometidos a un envejecimiento acelerado. La pendiente de liberación de estos compuestos es muy variable y dependiente del vino, de manera que los niveles finales alcanzados variaron en el rango 3-135 µg/L para el H2S y entre 1 y 15 µg/L para el MeSH. Prácticamente la totalidad de los vinos considerados potencialmente problemáticos por sus enólogos, tuvieron cantidades de BR-H2S tras envejecimiento acelerado superiores a 80 µg/L, mientras que los vinos embotellados generalmente tienen niveles por debajo de 50 µg/L. Como se había observado previamente, el máximo de concentración de BR-H2S se observa entre el inicio y las dos semanas de envejecimiento acelerado, lo que confirma que este tiempo es suficiente para generar el máximo nivel. Cerca de la mitad de los casos tuvieron niveles de Br-H2S máximos antes del envejecimiento acelerado, tal y como se había observado previamente con vinos comerciales embotellados, lo que sugiere que la formación “de novo” de H2S a partir de degradaciones catalíticas de metales, tiene lugar en un número limitado de vinos. Por el contrario, la concentración de MeSH BR no dejó de aumentar durante el envejecimiento acelerado en prácticamente todos los vinos, por lo que se puede concluir que, además del pequeño pool formado en fermentación, la fuente de este compuesto es la desulfuración del aminoácido metionina y mientras se den las condiciones adecuadas, no dejará de aumentar. El EtSH, que sólo se pudo detectar en un número limitado de muestras y en bajas concentraciones, no mostró acumulación, lo que sugiere que su formación es exclusivamente fermentativa.
6. Método de cromatografía de gases con detección de quimioluminiscencia para la determinación de manera simultánea de formas libres de compuestos volátiles (VSCs) y dióxido de azufre y para la determinación de formas acomplejadas con metales de VSCs.
Artículo enviado a J. Chromatogr. A
En este trabajo, se han desarrollado tres procedimientos diferentes para la evaluación cuantitativa de formas libres de los VSCs más importantes en el problema de reducción de los vinos junto con el SO2 libre real. Esto se ha conseguido al emplear un sistema totalmente inerte, una columna SPB-1 Sulfur, un sistema de criofocalización con nitrógeno líquido y un detector SCD, que permite que el SO2 se eluya dando un pico perfectamente gaussiano y no saturado, de manera que ha dejado de ser una interferencia y ha podido ser cuantificado. La mayor sensibilidad conseguida, permite obtener una señal claramente mensurable del etanotiol, dietilsulfuro, tioacetato de etilo y metilo, sulfuro de carbono.
La parte de optimización más delicada fue la inyección, en la que fue preciso optimizar las condiciones de criofocalización, la precolumna empleada, el volumen de inyección, la relación de Split y la velocidad de introducción de la muestra. Las mejores condiciones se consiguieron inyectando 1 mL de espacio de cabeza de un vial de 20 mL conteniendo 12 mL de muestra a una velocidad de 30 µL/s, con un split 1:2 y manteniendo el criotrap a una temperatura de -150 ºC para focalizar la muestra durante 0,8 min sobre una precolumna polar.
Los límites de detección del método desarrollado están por debajo de los umbrales de olfacción de los compuestos medidos, siendo inferior a 0,1 ppb para H2S, MeSH, EtSH y DMS. La repetibilidad, medida en vinos reales, es excelente, siendo en casi todos los casos menor del 10% para todos los compuestos y la linealidad del método es aceptable al cubrir el rango de aparición de estos compuestos en vino.
El método de análisis de formas libres se complementó con una nueva metodología para medir formas BRs. Gracias a la sensibilidad del sistema, se pudo reemplazar la preconcentración en fibra SPME empleada anteriormente, por una inyección del espacio de cabeza en equilibrio sobre la muestra diluida con salmuera a 70ºC durante 25 minutos. Pudimos constatar que la dilución con salmuera es estrictamente necesaria para conseguir romper los complejos tanto de cobre como de cinc, y que una dilución 1/10 representa la mejor solución de compromiso.
Los parámetros de validación de este método son también aceptables. La repetibilidad, medida como % DSR, es menor del 10% en prácticamente todos los casos. La linealidad es suficiente para cubrir el rango de aparición de estos compuestos en vino y los límites de detección son satisfactorios, oscilan desde 0,06 µg/L para el H2S hasta 1,35 µg/L para el DMS.
7. Efectos de los tratamientos con productos fitosanitarios de azufre y sulfato de cobre en uvas sobre la generación de problemas de reducción en vino
Artículo en preparación
Los vinos en los cuales las uvas se trataron con sulfato de cobre no se encontraron diferencias significativas respecto del control ni para H2S libre ni BR ni MeSH, contra lo esperado. Aparentemente, el cobre se perdió rápidamente de la masa de fermentación debido a la probable adsorción en las partes sólidas. Aunque los vinos tenían una concentración de cobre significativamente mayor que el control y el vino procedente de uvas tratadas con azufre, esta concentración estaba dentro del rango "normal" (57 contra 20 µg/L). También se encontraron diferencias significativas para la absorbancia a 520 nm y los niveles de β-damascenona en vinos de uvas tratadas con cobre.
Por el contrario, la presencia de azufre en las uvas tuvo un impacto drástico en los niveles de H2S y MeSH de los vinos. Los niveles de H2S libre fueron 19 µg /L, 7 veces por encima del control. Los niveles de MeSH libre fueron 3,8 µg/L, más de 4 veces por encima del control. Los niveles de formas BR también fueron mucho más altos que los de los controles en ambos casos, y las diferencias se mantuvieron después del envejecimiento acelerado en anoxia.
8. Estudio preliminar del efecto de las lías de levadura en el contenido de VSCs de los vinos que sufren problemas de reducción
Artículo en preparación (Estos resultados son preliminares y se complementarán con investigaciones adicionales).
Los tratamientos llevados a cabo con lías obtenidas del ensayo 3.7. fueron aparentemente extremadamente efectivos para reducir los niveles de H2S y MeSH tanto de libres como de acomplejados con metales. De los tres tipos de lías usadas (control, uvas tratadas con cobre y uvas tratadas con azufre) todas se comportan de manera similar, lo que sugiere que la historia previa del vino a partir de la cual se obtienen las lías tiene una influencia marginal en la eficiencia del tratamiento. Los niveles de H2S libre después del envejecimiento reductor se redujeron drásticamente en los cuatro vinos tratados (de 19 a 5,8; de 15 a 4,0; de 22 a 3,4 y de 30 a 7,3 µg/L). Los niveles de BR H2S tras el envejecimiento acelerado se redujeron de manera similar (de 120 a 40; de 70 a 14,2; de 130 a 16 o de 108 a 40 µg/L). La reducción de MeSH libre también fue clara (de 3,7 a 0,8; de 2 a 0,5; de 2,4 a 0,45; o de 5 a 1,25 µg/L). Incluso los niveles de DMS se redujeron significativamente (de 55 a 35; de 30 a 18; de 38 a 23; o de 22 a 13 µg/L).
CONCLUSIONES
• El tratamiento con bentonita disminuye la calidad organoléptica de los vinos debido a su impacto sobre los tioles varietales. Este efecto es mayor si el tratamiento se realiza al principio de la fermentación alcohólica que cuando se realiza en vino acabado.
• Los tratamientos con cobre tienen un efecto inmediato en la diminución de los niveles de H2S y MeSH. Sin embargo, dicha disminución es reversible cuando el vino es almacenado en anoxia. Los niveles de H2S libre aumentar más lentamente en muestras tratadas con cobre respecto de muestras con niveles más pequeños, aunque los niveles finales convergen. Los efectos sobre los niveles de MeSH a largo plazo son marginales. Se puede decir que los tratamientos con cobre retrasan el problema de reducción, pero no lo resuelven.
• Adicionalmente, se ha demostrado que altas dosis de cobre, pueden inducir la acumulación de niveles más altos de BR-H2S, lo que podría deberse a procesos de degradación catalítica de aminoácidos azufrados.
• La MOX también genera una diminución reversible de los niveles de H2S y MeSH tanto libres como BR. Sin embargo, los niveles se recuperan cuantitativamente cuando el vino es almacenado en anoxia. Tanto los BR-H2S como la ratio libre/BR H2S siguen una tendencia sigmoidea cuando se representan frente al potencial redox. Esto demuestra que la oxidación lenta que produce la micro-oxigenación no elimina el H2S ni los mercaptanos. Aunque sí genera un desplazamiento del equilibrio de libre a acomplejado con metales y finalmente a formas oxidadas.
• Todo esto sugiere que cada vino contiene una cantidad definida de "H2S total" presente bajo tres tipos de especies: libre, complejas y oxidadas. Dichas formas están interconectadas a través de equilibrios de formación de complejos y redox reversibles. La distribución entre especies depende del potencial redox del vino. A potenciales altos, dominan las formas oxidadas, mientras que a potenciales negativos lo hacen las formas reducidas (libres y complejas)
• El MeSH, aunque está también sometido a los mismos equilibrios, sus niveles aumentan de manera continua durante el envejecimiento por desulfuración catalizada por metales de metionina.
• Se ha determinado los rangos de concentraciones de las formas libres, BRs y totales (medidas tras envejecimiento acelerado) de un amplio conjunto de vinos, demostrándose que existe una gran variabilidad entre vinos en cuanto a su capacidad para acumular H2S y MeSH durante el envejecimiento anóxico.
• Basado en un sistema HS-criotrapping-GC-SCD, se ha conseguido un sistema analítico capaz de cuantificar de manera muy sensible y repetitiva los VSCs libres junto con el SO2 libre real. De manera complementaria, se ha desarrollado un segundo método basado en el análisis del espacio de cabeza sobre el vino diluido con salmuera y una incubación de 25 min a 70 ºC, para la determinación de las formas BRs.
• La presencia de sales de cobre (II) en las uvas no influye en la incidencia del problema de reducción de los vinos. Por el contrario, la presencia de azufre, tiene un impacto drástico en este problema.
• El trabajo preliminar con lías ha demostrado que los tratamientos con lías finas son muy efectivos para reducir los problemas de reducción de los vinos.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: quimica analitica ; vino
Titulación: Programa de Doctorado en Ciencia Analítica en Química
Plan(es): Plan 487
Nota: Presentado: 20 12 2018
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2018
Enlace permanente:
Registro creado el 2021-02-15, última modificación el 2021-05-20
