000108895 001__ 108895 000108895 005__ 20211216104758.0 000108895 037__ $$aTAZ-TFG-2021-2953 000108895 041__ $$aspa 000108895 1001_ $$adel Val García, Iris 000108895 24200 $$aResearch on orphan GPCRs from the central nervous system 000108895 24500 $$aEstudios de GPCRs huérfanos del sistema nervioso central 000108895 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza$$c2021 000108895 506__ $$aby-nc-sa$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ 000108895 520__ $$aLos receptores GPR3, GPR6 y GPR12 son receptores acoplados a proteínas G (GPCR) huérfanos con amplia distribución en el sistema nervioso central. Estos receptores están involucrados en la formación de neuritas, son posibles dianas de fármacos contra enfermedades neurodegenerativas y no hay ligando endógeno conocido que los active. Aunque son receptores con alta relevancia fisiológica y terapéutica, su función y localización subcelular no está clara. Se ha propuesto que estos receptores presentan actividad constitutiva, aunque en los ensayos descritos no se puede descartar la presencia de un posible agonista ubicuo desconocido; además, se desconocen los mecanismos de activación constitutivos y existe controversia sobre su posible acoplamiento dual tanto con proteína Gs como Gi/o. En este trabajo se determina que los receptores GPR3, 6 y 12 se localizan predominantemente en el interior celular, visto en células de insecto, células HEK293T y en líneas de neuroblastoma (SH-SY5Y), utilizando ensayos de biotinilización de superficie y microscopía de fluorescencia. Además, se demuestra que los receptores son constitutivamente activos y que pueden acoplarse a ambas proteínas Gs y Gi/o. Esto se consigue monitorizando el acoplamiento de proteínas G quiméricas (MiniGs399 y MiniGo12) por microscopía de fluorescencia en células, así como en ensayos in vitro de unión de proteínas (GFP-TS). Estos resultados se distinguen de los ya reportados en que no están basados en niveles de AMPc y reportan un caso infrecuente de receptores capaces de acoplar ambos tipos de proteínas G. Finalmente, se han generado variantes de GPR12 (15 de los 30 constructos generados en este trabajo) con el fin de aumentar la expresión en células de insecto, identificando regiones del receptor esenciales para la expresión y consiguiendo generar un baculovirus que expresa cantidades significativas de GPR3 funcional. Esto abre el camino a entender el mecanismo de activación constitutiva mediante determinación estructural por crio-microscopía electrónica.<br /><br /> 000108895 521__ $$aGraduado en Biotecnología 000108895 540__ $$aDerechos regulados por licencia Creative Commons 000108895 700__ $$aGarcía Nafría, Javier$$edir. 000108895 700__ $$aCarrodeguas Villar, José Alberto$$edir. 000108895 7102_ $$aUniversidad de Zaragoza$$b $$c 000108895 8560_ $$f761758@unizar.es 000108895 8564_ $$s14245958$$uhttps://zaguan.unizar.es/record/108895/files/TAZ-TFG-2021-2953.pdf$$yMemoria (spa) 000108895 909CO $$ooai:zaguan.unizar.es:108895$$pdriver$$ptrabajos-fin-grado 000108895 950__ $$a 000108895 951__ $$adeposita:2021-12-16 000108895 980__ $$aTAZ$$bTFG$$cCIEN 000108895 999__ $$a20210627191254.CREATION_DATE