Estudios de GPCRs huérfanos del sistema nervioso central

del Val García, Iris
García Nafría, Javier (dir.) ; Carrodeguas Villar, José Alberto (dir.)

Universidad de Zaragoza, CIEN, 2021

Graduado en Biotecnología

Abstract: Los receptores GPR3, GPR6 y GPR12 son receptores acoplados a proteínas G (GPCR) huérfanos con amplia distribución en el sistema nervioso central. Estos receptores están involucrados en la formación de neuritas, son posibles dianas de fármacos contra enfermedades neurodegenerativas y no hay ligando endógeno conocido que los active. Aunque son receptores con alta relevancia fisiológica y terapéutica, su función y localización subcelular no está clara. Se ha propuesto que estos receptores presentan actividad constitutiva, aunque en los ensayos descritos no se puede descartar la presencia de un posible agonista ubicuo desconocido; además, se desconocen los mecanismos de activación constitutivos y existe controversia sobre su posible acoplamiento dual tanto con proteína Gs como Gi/o. En este trabajo se determina que los receptores GPR3, 6 y 12 se localizan predominantemente en el interior celular, visto en células de insecto, células HEK293T y en líneas de neuroblastoma (SH-SY5Y), utilizando ensayos de biotinilización de superficie y microscopía de fluorescencia. Además, se demuestra que los receptores son constitutivamente activos y que pueden acoplarse a ambas proteínas Gs y Gi/o. Esto se consigue monitorizando el acoplamiento de proteínas G quiméricas (MiniGs399 y MiniGo12) por microscopía de fluorescencia en células, así como en ensayos in vitro de unión de proteínas (GFP-TS). Estos resultados se distinguen de los ya reportados en que no están basados en niveles de AMPc y reportan un caso infrecuente de receptores capaces de acoplar ambos tipos de proteínas G. Finalmente, se han generado variantes de GPR12 (15 de los 30 constructos generados en este trabajo) con el fin de aumentar la expresión en células de insecto, identificando regiones del receptor esenciales para la expresión y consiguiendo generar un baculovirus que expresa cantidades significativas de GPR3 funcional. Esto abre el camino a entender el mecanismo de activación constitutiva mediante determinación estructural por crio-microscopía electrónica.

Tipo de Trabajo Académico: Trabajo Fin de Grado