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000128179 005__ 20231123151842.0
000128179 037__ $$aTESIS-2023-215
000128179 041__ $$aspa
000128179 1001_ $$aValledor Martín, Silvia
000128179 24500 $$aDiseño y generación de partículas virales recombinantes de rna para su uso en productos de diagnostico molecular.
000128179 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad$$c2021
000128179 300__ $$a200
000128179 4900_ $$aTesis de la Universidad de Zaragoza$$v2023-214$$x2254-7606
000128179 500__ $$aPresentado: 26 10 2021
000128179 502__ $$aTesis-Univ. Zaragoza, , 2021$$bZaragoza, Universidad de Zaragoza$$c2021
000128179 506__ $$aby-nc-nd$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es
000128179 520__ $$aLa reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se ha convertido en una de las<br />técnicas de elección en el diagnóstico clínico por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Esta<br />técnica se ha implementado como reemplazo o apoyo a las técnicas de diagnóstico<br />convencionales, ya que su rapidez y fiabilidad permiten, además de identificar al agente<br />etiológico de la enfermedad, orientar el tratamiento del paciente, contener la infección y frenar<br />los contagios. Recientemente, su papel en el control de la pandemia por el Coronavirus de tipo<br />2 causante del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2) ha sido crucial para llevar a<br />cabo un buen control epidemiológico. Además, esta técnica permite cuantificar el número de<br />copias de un gen diana en particular, lo que resulta muy valioso como indicador de la evolución<br />de un paciente a un determinado tratamiento.<br />El incremento de la disponibilidad de ensayos qPCR debe ir asociado a una mayor disponibilidad<br />de materiales de referencia, esto es, controles del proceso que permitan validar la técnica y<br />detectar posibles resultados falsos positivos o negativos, los cuales podrían tener un impacto<br />desfavorable en la salud del paciente y en el control de la enfermedad. Por otra parte, estos<br />controles son necesarios para comparar la sensibilidad y especificidad entre diferentes ensayos<br />qPCR, interpretar los resultados de los análisis inter- e intra-laboratorio o llevar a cabo estudios<br />de validación de ensayos qPCR cumpliendo la normativa vigente. Sin embargo, a pesar de su<br />relevancia, la disponibilidad de controles del proceso para ensayos qPCR es limitada, ya sea por<br />la escasa disponibilidad de muestras clínicas, en el caso de patógenos emergentes, exóticos y/o<br />endémicos, la dificultad técnica de su cultivo o la necesidad de instalaciones de alto nivel de<br />bioseguridad para su manipulación.<br />Un control de proceso debe cumplir idealmente los siguientes requisitos: monitorizar todas las<br />etapas del proceso, presentar una estructura similar a la muestra testada, ser no infeccioso,<br />reproducible, estable en el tiempo y aplicable a una amplia gama de ensayos.<br />Existen en el mercado diferentes tipos de controles, en su mayoría consistentes en secuencias<br />sintéticas de DNA, plásmidos que contienen el DNA de interés o secuencias de RNA obtenidas<br />por transcripción in vitro. Estos controles permiten monitorizar la reacción de qPCR, pero no<br />monitorizan con fidelidad el paso previo de extracción de ácidos nucleicos, ya que no imitan al<br />patógeno que se desea identificar, carecen de estructura externa y son susceptibles a la<br />degradación por nucleasas; y, en el caso de las secuencias sintéticas de DNA o DNA plasmídico,<br />tampoco se monitoriza la etapa previa de retrotranscripción. Por otra parte, se comercializan<br />cepas de diferentes bacterias, virus o parásitos que son aislados de pacientes con infección y<br />permiten la monitorización completa del proceso de qPCR (incluyendo la extracción de ácidos<br />nucleicos), pero, en algunos casos, su manipulación requiere medidas y contención propia de un<br />nivel de bioseguridad 3 o superior, por lo que se precisa de instalaciones muy concretas y<br />personal experimentado.<br />En este proyecto de investigación se propone una estrategia, basada en la transfección de<br />células eucariotas con plásmidos lentivirales, para la generación in vitro de partículas virales<br />recombinantes, no infecciosas y de genoma RNA, dando respuesta a las limitaciones<br />anteriormente comentadas. Los vectores lentivirales están ampliamente extendidos en el<br />campo de la terapia génica, en virología o en el desarrollo de vacunas, sin embargo, su aplicación<br />para la generación de controles de proceso de los ensayos de qPCR es novedosa.<br />Esta tecnología explota la capacidad que poseen los virus de empaquetar un ácido nucleico<br />exógeno, siempre que su tamaño no exceda el límite del sistema y su secuencia contenga unas mínimas señales de empaquetamiento. Se trata de un sistema muy versátil, mediante el cual es<br />posible crear infinidad de controles, cuya estructura externa sea común a todos ellos<br />(correspondiente a lentivirus) y el genoma empaquetado variable, en función del control de<br />proceso diseñado.<br />En el presente proyecto, para la generación in vitro de partículas virales recombinantes de<br />genoma RNA ha sido necesario, en primer lugar, la confección de una colección de plásmidos<br />que contengan fragmentos del genoma o el genoma completo de los virus de interés. En<br />segundo lugar, la puesta a punto de un protocolo de generación de partículas virales y,<br />finalmente, la purificación de las partículas virales, su cuantificación por PCR digital y su<br />estabilización mediante liofilización. Las partículas virales desarrolladas se han validado para su<br />uso como control positivo de ensayos de RT-qPCR, evaluando su funcionalidad tras ser<br />procesadas por diferentes sistemas de extracción de ácidos nucleicos y diferentes ensayos de<br />PCR en tiempo real, así como su reproducibilidad y repetibilidad. También se han realizado<br />diferentes ensayos orientados a determinar la vida útil del producto y su estabilidad en<br />diferentes condiciones. Por último, se ha evaluado su capacidad infectiva y se ha verificado,<br />mediante secuenciación masiva, la secuencia del RNA contenido en las partículas virales.<br />Los resultados obtenidos indican que las partículas virales sintetizadas en este proyecto:<br />¿ Son partículas virales no infecciosas y defectivas para la replicación. Todas las partículas<br />virales creadas mediante este sistema pueden ser manipuladas en nivel de bioseguridad<br />tipo 2.<br />¿ Son un control fiable del proceso de extracción de ácidos nucleicos, ya que mimetizan<br />la estructura de un virus salvaje, por lo que se consigue una monitorización completa<br />del proceso, desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la amplificación por qPCR,<br />incluyendo la etapa previa de retrotranscripción.<br />¿ Se trata de un producto reproducible y estable en el tiempo. Se presenta en formato<br />liofilizado, por lo que se puede transportar y almacenar a temperatura ambiente, y<br />presenta una vida útil de dos años.<br />¿ De uso universal. Son compatibles con cualquier sistema optimizado de extracción de<br />ácidos nucleicos y PCR en tiempo real y accesibles a cualquier laboratorio, sin necesidad<br />de instalaciones y medidas de contención propias de un nivel de bioseguridad elevado.<br />
000128179 520__ $$a<br />
000128179 521__ $$97073$$aPrograma de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
000128179 6531_ $$abiología molecular
000128179 6531_ $$aretrovirus
000128179 6531_ $$amicrobiología
000128179 6531_ $$abiotecnología
000128179 700__ $$aTomás Mateo, Elena De $$edir.
000128179 700__ $$aGómez-Moreno Calera, Carlos $$edir.
000128179 7102_ $$aUniversidad de Zaragoza$$b
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000128179 8560_ $$fcdeurop@unizar.es
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