Lakhssassi , Kenza
Calvo Lacosta, Jorge Hugo (dir.) ; Serrano Noreña, Magdalena (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Resumen: En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado la base genética de la estacionalidad reproductiva en hembras y otros factores que influyen en la misma, así como de la capacidad de cubrición de los machos en época de anestro reproductivo (AR) en animales de la raza ovina Rasa Aragonesa, mediante herramientas genómicas de genotipado de SNPs y secuenciación masiva de nueva generación.
En primer lugar, mediante la aproximación de gen candidato se aisló parcialmente el gen LEPR, y se asociaron 2 SNPs a caracteres de estacionalidad reproductiva en ovejas. Se identificaron un total de 18 SNPs en ovejas con valores extremos para fenotipos de estacionalidad, que fueron el número total de días de anestro (DTA) y ciclicidad por progesterona (CiP4), ambos asociados a la función ovárica y basados en la medición de los niveles de progesterona (P4) en sangre; y el fenotipo ciclicidad por celos (CiC), basado en los signos de comportamiento estral. Seis de los SNPs fueron sustituciones no sinónimas, y dos de ellos se predijeron in silico como deletéreos: rs596133197 y rs403578195. El estudio de asociación de los polimorfismos encontrados en el gen fue llevado a cabo en 239 ovejas. Este estudio reveló que el SNP rs403578195, localizado en el exón 8 y que produce un cambio de alanina por glicina (Ala284Gly) en el dominio extracelular de la proteína, se asoció con un incremento del 12% del carácter CiC en las ovejas con el genotipo CC comparado con las heterocigotas GC. Los análisis de asociación haplotípica también sugirieron la implicación de otro SNP no sinónimo localizado en el exón 20 (rs405459906). Este SNP produce un cambio aminoacídico (Lys1069Glu) en el dominio intracelular de la proteína y segrega independientemente del rs403578195. En un segundo estudio, se llevó a cabo un análisis de asociación a genoma completo (GWAS) sobre los mismos caracteres de estacionalidad incluyendo 205 ovejas genotipadas con los chips Illumina de 50K y 600K. Solo un SNP (rs404991855) asociado con el fenotipo CiP4 superó el umbral de significación genómica. Nueve SNPs exhibieron asociaciones significativas a nivel cromosómico (FDR < 0,10), estando los SNPs rs404991855 y rs418191944, localizados en el gen de la molécula CD226 (CD226) relacionado con enfermedades reproductivas, asociados a los tres caracteres de estacionalidad reproductiva. Otros dos SNPs se ubicaron cerca del gen neuropéptido Y (NPY), que está involucrado en los ritmos circadianos. Para validar los resultados del GWAS, se realizó la caracterización parcial de ambos genes por secuenciación SANGER en animales con valores extremos para estos caracteres, encontrando dos SNPs sinónimos y dos no sinónimos en los genes NPY y CD226, respectivamente. El análisis de asociación de estos SNPs mostró que sólo el SNP rs404360094 situado en el exón 3 del gen CD226, y que produce una sustitución
aminoacídica de asparagina (polar sin carga) a ácido aspártico (ácido), se asocia con los tres caracteres de estacionalidad.
Por otra parte, dado que la condición corporal (CC) y el peso vivo (PV) de la oveja juegan un papel importante en el desempeño productivo y reproductivo, se llevó a cabo otro análisis GWAS para detectar variantes genéticas asociadas a los caracteres de crecimiento en 225 ovejas adultas genotipadas con los chips de media y alta densidad Illumina Ovine BeadChip. A estas ovejas se les controló y registró la CC, PV y tasa de crecimiento (TC) de enero a septiembre durante 2 años (2011 y 2012). Se estimaron los fenotipos corregidos para CC, PV y TC, que fueron utilizados posteriormente para el análisis GWAS. Sólo el SNP rs425509273 en el cromosoma 9 (OAR9), mostró una significación a nivel genómico para el fenotipo TC. Uno, tres y nueve SNPs se asociaron a nivel cromosómico con un FDR < 0,10 con los caracteres CC, PV y TC, respectivamente. El gen candidato CYP7B1, ubicado a 83 kb del SNP rs425509273 y asociado con la TC, se aisló parcialmente y se buscaron polimorfismos mediante secuenciacion SANGER en animales extremos para el fenotipo TC. Se detectaron 15 polimorfismos:12 SNPs, dos indels y un poliC, localizados todos en la región 5¿ del gen. El análisis de asociación de los polimorfismos ubicados cerca del sitio de inicio de la transcripción (TSS) mostró que una inserción de 22 pb ubicada a -58 nucleótidos del TSS (indel (-58)), un poliC (-25) y dos SNPs A/G (SNP3 (-114) y SNP5 (-63)) se asociaron con la TC, mientras que solo el indel (-58) se asoció con la CC. El análisis de asociación haplotípica confirmó estos resultados. La caracterización funcional de los polimorfismos del gen CYP7B1 en hígado mediante la metodología de PCR cuantitativa en tiempo real tras transcripción inversa (RT-qPCR) confirmó que las mutaciones en la región promotora afectaban a la tasa de expresión del gen CYP7B1.
Con el objetivo de identificar nuevos genes y rutas metabólicas implicadas en la activación del ovario en AR se llevó a cabo un análisis del transcriptoma mediante RNA-Seq del pars tuberalis (PT) e hipotálamo (HT) en 21 ovejas en diferentes fases ováricas, folicular (F) y luteal (L) del ciclo estral, y en AR. En HT, se encontraron 72 y 3 genes diferencialmente expresados (GDEs) al comparar F vs. AR y L vs. AR, respectivamente. En PT, se encontraron 6 y 4 GDEs en las comparaciones F vs. AR y L vs. AR, respectivamente. El análisis de enriquecimiento funcional con DAVID de GDEs entre las fases F y AR en el HT reveló grupos de genes significativamente asociados con la unión de actina y el citoesqueleto, relacionados con la plasticidad neuronal modulada por las hormonas esteroides gonadales, así como con la señalización de oxitocina. Los GDEs en PT mostraron mayores diferencias en los niveles de expresión que los encontrados en HT. En este sentido, el ITLN estaba altamente sobreexpresado en las fases F y L vs. AR, siendo MRPL57 e IRX4 altamente subexpresados en la comparación L vs. AR. El gen DDC en PT, relacionado con la regulación de LH, mostro una sobreexpresión en la fase F. El análisis de enriquecimiento funcional de conjuntos de genes (GSEA) reveló múltiples vías relacionadas con la neurotransmisión y la plasticidad neuronal.
Finalmente, para comprender los mecanismos del comportamiento sexual en moruecos, se utilizó también la tecnología de secuenciación masiva del transcriptoma para identificar GDEs en HT, PT, glándula pineal (GP) y sangre en 12 machos de Rasa Aragonesa con diferente actividad sexual (6 sexualmente activos (A) y 6 no activos
(NA)). El análisis bioinformático de los 16.401 genes identificados por RNA-Seq reveló 103 y 12 GDEs en HT y GP, respectivamente, con un FDR < 0,05, y con un valor absoluto de log2FC ¿ 1. Sin embargo, no se encontraron GDEs en el PT. En sangre, de un total de 14.078 genes expresados solo cuatro fueron GDEs (FDR < 0,10) en la
comparación de machos A frente a NA. La anotación funcional y el análisis de enriquecimiento de rutas mostraron que los GDEs de HT estaban enriquecidos principalmente en interacciones neuroactivas ligando-receptor y vías de señalización, incluyendo genes candidatos notables como MTNR1A, CHRNA2, FSHB, LHB, GNRHR, AVP, PRL, PDYN, CGA, GABRD y TSHB, que desempeñan un papel crucial en el comportamiento sexual. También se destacaron las vías de señalización GnRH y cAMP. Además, GSEA identificó vías potenciales, dominadas principalmente por la categoría de procesos biológicos, que podrían ser responsables de las diferencias en el comportamiento sexual observadas en los machos. El transporte intracelular de proteínas y el proceso de especificación de patrones se enriquecieron en el PT, mientras que las vías de unión de factores de transcripción y ubiquitinación de proteínas en la GP. La validación de 5 GDEs mediante RT-qPCR confirmaron los resultados obtenidos por RNA-Seq. En sangre, sólo los genes, inhibidor de acrosina 1 (ENSOARG00020023278) y SORCS2 mostraron sobreexpresión (log2FC > 1) en machos activos, mientras que los genes CRYL1 y la isoforma X47 de la cadena ligera lambda-1 de inmunoglobulina (ENSOARG00020025518) estaban subexpresados (log2FC < -1) en este mismo grupo. El GSEA realizado con todos los genes expresados en sangre identificó 428 vías de señalización, predominantemente relacionadas con procesos biológicos. La vía de los lisosomas (GO:0005764) fue la más enriquecida, que podría afectar a la fertilidad y al comportamiento sexual, dado el papel crucial que desempeñan los lisosomas en la esteroidogénesis, estando el gen SORCS2 relacionado con esta vía de señalización. Además, la vía enriquecida de la regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2 (GO:0070374) se asocia con fenotipos reproductivos como la fertilidad a través de la modulación de la regulación hipotalámica y la producción de gonadotropinas hipofisarias mediada por GnRH. También se enriquecieron las vías del lado externo de la membrana plasmática (GO:0009897), el centro fibrilar (GO:0001650), la adhesión focal (GO:0005925) y el lamellipodio (GO:0030027), lo que sugiere que algunas moléculas de estas vías también podrían estar implicadas en el comportamiento sexual de los moruecos. Por lo tanto, estas vías en conjunto pueden jugar un papel importante en la regulación del comportamiento sexual en machos de raza Rasa Aragonesa a través del eje hipotálamo-pituitario-gonadal.
En conclusión, los estudios de asociación mediante GWAS y la aproximación de gen candidato permitieron asociar por primera vez polimorfismos en los genes LEPR y CD226 con los caracteres de estacionalidad reproductiva. Por otra parte, los polimorfismos localizados en el promotor del gen CYP7B1 se asociaron con los caracteres de crecimiento, que son factores que influyen de manera importante en la estacionalidad reproductiva de la raza Rasa Aragonesa. El estudio del transcriptoma en hembras reveló nuevos genes candidatos involucrados en las transiciones de las fases reproductivas en ovejas estacionales. Mientras que los resultados del estudio del transcriptoma en machos contribuyen a comprender la base genética de su comportamiento sexual demostrando que múltiples redes y vías orquestan el comportamiento sexual en moruecos. Los genes descubiertos mediante estos estudios podrían constituirse en marcadores moleculares potenciales para ser utilizados en la selección asistida por marcadores para mejorar la estacionalidad reproductiva en hembras y el comportamiento sexual de machos en la especie ovina.
Resumen (otro idioma):
En primer lugar, mediante la aproximación de gen candidato se aisló parcialmente el gen LEPR, y se asociaron 2 SNPs a caracteres de estacionalidad reproductiva en ovejas. Se identificaron un total de 18 SNPs en ovejas con valores extremos para fenotipos de estacionalidad, que fueron el número total de días de anestro (DTA) y ciclicidad por progesterona (CiP4), ambos asociados a la función ovárica y basados en la medición de los niveles de progesterona (P4) en sangre; y el fenotipo ciclicidad por celos (CiC), basado en los signos de comportamiento estral. Seis de los SNPs fueron sustituciones no sinónimas, y dos de ellos se predijeron in silico como deletéreos: rs596133197 y rs403578195. El estudio de asociación de los polimorfismos encontrados en el gen fue llevado a cabo en 239 ovejas. Este estudio reveló que el SNP rs403578195, localizado en el exón 8 y que produce un cambio de alanina por glicina (Ala284Gly) en el dominio extracelular de la proteína, se asoció con un incremento del 12% del carácter CiC en las ovejas con el genotipo CC comparado con las heterocigotas GC. Los análisis de asociación haplotípica también sugirieron la implicación de otro SNP no sinónimo localizado en el exón 20 (rs405459906). Este SNP produce un cambio aminoacídico (Lys1069Glu) en el dominio intracelular de la proteína y segrega independientemente del rs403578195. En un segundo estudio, se llevó a cabo un análisis de asociación a genoma completo (GWAS) sobre los mismos caracteres de estacionalidad incluyendo 205 ovejas genotipadas con los chips Illumina de 50K y 600K. Solo un SNP (rs404991855) asociado con el fenotipo CiP4 superó el umbral de significación genómica. Nueve SNPs exhibieron asociaciones significativas a nivel cromosómico (FDR < 0,10), estando los SNPs rs404991855 y rs418191944, localizados en el gen de la molécula CD226 (CD226) relacionado con enfermedades reproductivas, asociados a los tres caracteres de estacionalidad reproductiva. Otros dos SNPs se ubicaron cerca del gen neuropéptido Y (NPY), que está involucrado en los ritmos circadianos. Para validar los resultados del GWAS, se realizó la caracterización parcial de ambos genes por secuenciación SANGER en animales con valores extremos para estos caracteres, encontrando dos SNPs sinónimos y dos no sinónimos en los genes NPY y CD226, respectivamente. El análisis de asociación de estos SNPs mostró que sólo el SNP rs404360094 situado en el exón 3 del gen CD226, y que produce una sustitución
aminoacídica de asparagina (polar sin carga) a ácido aspártico (ácido), se asocia con los tres caracteres de estacionalidad.
Por otra parte, dado que la condición corporal (CC) y el peso vivo (PV) de la oveja juegan un papel importante en el desempeño productivo y reproductivo, se llevó a cabo otro análisis GWAS para detectar variantes genéticas asociadas a los caracteres de crecimiento en 225 ovejas adultas genotipadas con los chips de media y alta densidad Illumina Ovine BeadChip. A estas ovejas se les controló y registró la CC, PV y tasa de crecimiento (TC) de enero a septiembre durante 2 años (2011 y 2012). Se estimaron los fenotipos corregidos para CC, PV y TC, que fueron utilizados posteriormente para el análisis GWAS. Sólo el SNP rs425509273 en el cromosoma 9 (OAR9), mostró una significación a nivel genómico para el fenotipo TC. Uno, tres y nueve SNPs se asociaron a nivel cromosómico con un FDR < 0,10 con los caracteres CC, PV y TC, respectivamente. El gen candidato CYP7B1, ubicado a 83 kb del SNP rs425509273 y asociado con la TC, se aisló parcialmente y se buscaron polimorfismos mediante secuenciacion SANGER en animales extremos para el fenotipo TC. Se detectaron 15 polimorfismos:12 SNPs, dos indels y un poliC, localizados todos en la región 5¿ del gen. El análisis de asociación de los polimorfismos ubicados cerca del sitio de inicio de la transcripción (TSS) mostró que una inserción de 22 pb ubicada a -58 nucleótidos del TSS (indel (-58)), un poliC (-25) y dos SNPs A/G (SNP3 (-114) y SNP5 (-63)) se asociaron con la TC, mientras que solo el indel (-58) se asoció con la CC. El análisis de asociación haplotípica confirmó estos resultados. La caracterización funcional de los polimorfismos del gen CYP7B1 en hígado mediante la metodología de PCR cuantitativa en tiempo real tras transcripción inversa (RT-qPCR) confirmó que las mutaciones en la región promotora afectaban a la tasa de expresión del gen CYP7B1.
Con el objetivo de identificar nuevos genes y rutas metabólicas implicadas en la activación del ovario en AR se llevó a cabo un análisis del transcriptoma mediante RNA-Seq del pars tuberalis (PT) e hipotálamo (HT) en 21 ovejas en diferentes fases ováricas, folicular (F) y luteal (L) del ciclo estral, y en AR. En HT, se encontraron 72 y 3 genes diferencialmente expresados (GDEs) al comparar F vs. AR y L vs. AR, respectivamente. En PT, se encontraron 6 y 4 GDEs en las comparaciones F vs. AR y L vs. AR, respectivamente. El análisis de enriquecimiento funcional con DAVID de GDEs entre las fases F y AR en el HT reveló grupos de genes significativamente asociados con la unión de actina y el citoesqueleto, relacionados con la plasticidad neuronal modulada por las hormonas esteroides gonadales, así como con la señalización de oxitocina. Los GDEs en PT mostraron mayores diferencias en los niveles de expresión que los encontrados en HT. En este sentido, el ITLN estaba altamente sobreexpresado en las fases F y L vs. AR, siendo MRPL57 e IRX4 altamente subexpresados en la comparación L vs. AR. El gen DDC en PT, relacionado con la regulación de LH, mostro una sobreexpresión en la fase F. El análisis de enriquecimiento funcional de conjuntos de genes (GSEA) reveló múltiples vías relacionadas con la neurotransmisión y la plasticidad neuronal.
Finalmente, para comprender los mecanismos del comportamiento sexual en moruecos, se utilizó también la tecnología de secuenciación masiva del transcriptoma para identificar GDEs en HT, PT, glándula pineal (GP) y sangre en 12 machos de Rasa Aragonesa con diferente actividad sexual (6 sexualmente activos (A) y 6 no activos
(NA)). El análisis bioinformático de los 16.401 genes identificados por RNA-Seq reveló 103 y 12 GDEs en HT y GP, respectivamente, con un FDR < 0,05, y con un valor absoluto de log2FC ¿ 1. Sin embargo, no se encontraron GDEs en el PT. En sangre, de un total de 14.078 genes expresados solo cuatro fueron GDEs (FDR < 0,10) en la
comparación de machos A frente a NA. La anotación funcional y el análisis de enriquecimiento de rutas mostraron que los GDEs de HT estaban enriquecidos principalmente en interacciones neuroactivas ligando-receptor y vías de señalización, incluyendo genes candidatos notables como MTNR1A, CHRNA2, FSHB, LHB, GNRHR, AVP, PRL, PDYN, CGA, GABRD y TSHB, que desempeñan un papel crucial en el comportamiento sexual. También se destacaron las vías de señalización GnRH y cAMP. Además, GSEA identificó vías potenciales, dominadas principalmente por la categoría de procesos biológicos, que podrían ser responsables de las diferencias en el comportamiento sexual observadas en los machos. El transporte intracelular de proteínas y el proceso de especificación de patrones se enriquecieron en el PT, mientras que las vías de unión de factores de transcripción y ubiquitinación de proteínas en la GP. La validación de 5 GDEs mediante RT-qPCR confirmaron los resultados obtenidos por RNA-Seq. En sangre, sólo los genes, inhibidor de acrosina 1 (ENSOARG00020023278) y SORCS2 mostraron sobreexpresión (log2FC > 1) en machos activos, mientras que los genes CRYL1 y la isoforma X47 de la cadena ligera lambda-1 de inmunoglobulina (ENSOARG00020025518) estaban subexpresados (log2FC < -1) en este mismo grupo. El GSEA realizado con todos los genes expresados en sangre identificó 428 vías de señalización, predominantemente relacionadas con procesos biológicos. La vía de los lisosomas (GO:0005764) fue la más enriquecida, que podría afectar a la fertilidad y al comportamiento sexual, dado el papel crucial que desempeñan los lisosomas en la esteroidogénesis, estando el gen SORCS2 relacionado con esta vía de señalización. Además, la vía enriquecida de la regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2 (GO:0070374) se asocia con fenotipos reproductivos como la fertilidad a través de la modulación de la regulación hipotalámica y la producción de gonadotropinas hipofisarias mediada por GnRH. También se enriquecieron las vías del lado externo de la membrana plasmática (GO:0009897), el centro fibrilar (GO:0001650), la adhesión focal (GO:0005925) y el lamellipodio (GO:0030027), lo que sugiere que algunas moléculas de estas vías también podrían estar implicadas en el comportamiento sexual de los moruecos. Por lo tanto, estas vías en conjunto pueden jugar un papel importante en la regulación del comportamiento sexual en machos de raza Rasa Aragonesa a través del eje hipotálamo-pituitario-gonadal.
En conclusión, los estudios de asociación mediante GWAS y la aproximación de gen candidato permitieron asociar por primera vez polimorfismos en los genes LEPR y CD226 con los caracteres de estacionalidad reproductiva. Por otra parte, los polimorfismos localizados en el promotor del gen CYP7B1 se asociaron con los caracteres de crecimiento, que son factores que influyen de manera importante en la estacionalidad reproductiva de la raza Rasa Aragonesa. El estudio del transcriptoma en hembras reveló nuevos genes candidatos involucrados en las transiciones de las fases reproductivas en ovejas estacionales. Mientras que los resultados del estudio del transcriptoma en machos contribuyen a comprender la base genética de su comportamiento sexual demostrando que múltiples redes y vías orquestan el comportamiento sexual en moruecos. Los genes descubiertos mediante estos estudios podrían constituirse en marcadores moleculares potenciales para ser utilizados en la selección asistida por marcadores para mejorar la estacionalidad reproductiva en hembras y el comportamiento sexual de machos en la especie ovina.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: genética animal ; genética molecular ; biología molecular ; selección animal
Titulación: Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas
Plan(es): Plan 495
Área de conocimiento: Ciencias de la Salud
Nota: Presentado: 31 10 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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Registro creado el 2024-03-06, última modificación el 2024-03-06
