Giraldos Jimenez, David
Anel Bernal, Luis Alberto (dir.) ; Naval Iraberri, José Javier (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Resumen: La terapia celular adoptiva y el uso de anticuerpos monoclonales son dos modalidades de la inmunoterapia que se han combinado a lo largo de este trabajo. Por un lado, se han utilizado diferentes células asesinas naturales (NK), y por el otro, el anticuerpo anti-CD38 daratumumab.
Daratumumab se combinó inicialmente con células NK activadas y expandidas (eNK) in vitro, siguiendo un protocolo desarrollado con anterioridad en nuestro laboratorio. Esto resultó en una considerable actividad citotóxica sobre líneas celulares de mieloma múltiple (MM) humano. Dicha actividad fue dependiente mayoritariamente de la vía de los gránulos citotóxicos (perforina/granzima B), mientras que los ligandos de los receptores mortales sólo ejercían un efecto minoritario en base a la sensibilidad propia de cada línea. El problema de estas células para ser consideradas como el modelo sobre el que seguir trabajando radicó en la variabilidad entre donantes a partir de los cuales se extraían las células NK para ser activadas.
Como alternativa de modelo se utilizó la línea celular NK-92. Estas células presentaban una actividad citotóxica mayor que la de las células eNK, aunque en este caso exclusivamente dependiente de la vía de los gránulos citotóxicos. No obstante, al carecer de la expresión del receptor CD16 no podían ser utilizadas junto a daratumumab. Se realizó por lo tanto una transfección para resolver ese punto crítico mediante una modificación genética. Una vez confirmada la expresión de CD16 en la nueva línea NK-92-CD16 generada, y su estabilidad, se ensayaron estas células en combinación con daratumumab sobre líneas celulares de MM humano. Los resultados obtenidos sobre dichas líneas in vitro fueron excelentes en múltiples condiciones (cultivos en 2D y en 3D, a ratios efector-diana muy bajos, etc). Si bien la modificación genética no alteró la dependencia exclusiva de la ruta de los gránulos citotóxicos, sí que parece que aumentó la expresión de moléculas citotóxicas implicadas en ella y en otras vías (granzima B y TRAIL). En vista del potencial terapéutico mostrado, las células NK-92-CD16 se enfrentaron en presencia de daratumumab a células plasmáticas de diversos pacientes de MM. A pesar de tratarse de muestras reales más complejas, los resultados fueron positivos, llegando incluso a revertir situaciones de resistencia a tratamientos previos.
La irradiación de las células NK-92-CD16 por cuestiones de seguridad a la hora de ser administradas a los pacientes no pareció repercutir gravemente en su actividad citotóxica, aunque sí garantizó anular su potencial replicativo a tiempos superiores a 48 horas.
Posteriormente, sobre este modelo de células NK-92-CD16 se generó un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-SLAMF7 con una segunda modificación genética. Se consiguió una transfección estable del CAR, pero el porcentaje de células positivas no superó el 50% y su actividad citotóxica sobre las líneas de MM no fue superior a la de las células NK-92-CD16.
Finalmente, se llevó a cabo un experimento in vivo en un modelo de ratones inmunodeprimidos NSG xenoinjertado subcutáneamente con el MM humano MM.1S-GFP-Luc. Aunque no llegaron a obtenerse resultados estadísticamente significativos, la tendencia positiva obtenida sobre todo en el grupo tratado con las células CAR-NK-92-CD16 anti-SLAMF7 combinado con daratumumab indica la actividad terapéutica del modelo celular generado.
Resumen (otro idioma):
Daratumumab se combinó inicialmente con células NK activadas y expandidas (eNK) in vitro, siguiendo un protocolo desarrollado con anterioridad en nuestro laboratorio. Esto resultó en una considerable actividad citotóxica sobre líneas celulares de mieloma múltiple (MM) humano. Dicha actividad fue dependiente mayoritariamente de la vía de los gránulos citotóxicos (perforina/granzima B), mientras que los ligandos de los receptores mortales sólo ejercían un efecto minoritario en base a la sensibilidad propia de cada línea. El problema de estas células para ser consideradas como el modelo sobre el que seguir trabajando radicó en la variabilidad entre donantes a partir de los cuales se extraían las células NK para ser activadas.
Como alternativa de modelo se utilizó la línea celular NK-92. Estas células presentaban una actividad citotóxica mayor que la de las células eNK, aunque en este caso exclusivamente dependiente de la vía de los gránulos citotóxicos. No obstante, al carecer de la expresión del receptor CD16 no podían ser utilizadas junto a daratumumab. Se realizó por lo tanto una transfección para resolver ese punto crítico mediante una modificación genética. Una vez confirmada la expresión de CD16 en la nueva línea NK-92-CD16 generada, y su estabilidad, se ensayaron estas células en combinación con daratumumab sobre líneas celulares de MM humano. Los resultados obtenidos sobre dichas líneas in vitro fueron excelentes en múltiples condiciones (cultivos en 2D y en 3D, a ratios efector-diana muy bajos, etc). Si bien la modificación genética no alteró la dependencia exclusiva de la ruta de los gránulos citotóxicos, sí que parece que aumentó la expresión de moléculas citotóxicas implicadas en ella y en otras vías (granzima B y TRAIL). En vista del potencial terapéutico mostrado, las células NK-92-CD16 se enfrentaron en presencia de daratumumab a células plasmáticas de diversos pacientes de MM. A pesar de tratarse de muestras reales más complejas, los resultados fueron positivos, llegando incluso a revertir situaciones de resistencia a tratamientos previos.
La irradiación de las células NK-92-CD16 por cuestiones de seguridad a la hora de ser administradas a los pacientes no pareció repercutir gravemente en su actividad citotóxica, aunque sí garantizó anular su potencial replicativo a tiempos superiores a 48 horas.
Posteriormente, sobre este modelo de células NK-92-CD16 se generó un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-SLAMF7 con una segunda modificación genética. Se consiguió una transfección estable del CAR, pero el porcentaje de células positivas no superó el 50% y su actividad citotóxica sobre las líneas de MM no fue superior a la de las células NK-92-CD16.
Finalmente, se llevó a cabo un experimento in vivo en un modelo de ratones inmunodeprimidos NSG xenoinjertado subcutáneamente con el MM humano MM.1S-GFP-Luc. Aunque no llegaron a obtenerse resultados estadísticamente significativos, la tendencia positiva obtenida sobre todo en el grupo tratado con las células CAR-NK-92-CD16 anti-SLAMF7 combinado con daratumumab indica la actividad terapéutica del modelo celular generado.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: inmunología ; biología celular ; bioquímica inmunológica ; bioquímica molecular
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 03 11 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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Registro creado el 2024-03-19, última modificación el 2024-03-19
