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000135526 005__ 20240603114422.0
000135526 037__ $$aTESIS-2024-208
000135526 041__ $$aeng
000135526 1001_ $$aLanda Baila, Guillermo
000135526 24500 $$aDevelopment of Nanosystems Based on Molecules of Biological Origin for the Monitoring and Treatment of Bacterial Infections
000135526 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad$$c2024
000135526 300__ $$a222
000135526 4900_ $$aTesis de la Universidad de Zaragoza$$v2024-200$$x2254-7606
000135526 500__ $$aPresentado: 20 02 2024
000135526 502__ $$aTesis-Univ. Zaragoza, , 2024$$bZaragoza, Universidad de Zaragoza$$c2024
000135526 506__ $$aby-nc$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/es
000135526 520__ $$aLa presente tesis doctoral, titulada "Development of nanosystems based on molecules of biological origin for the monitoring and treatment of bacterial infections" (Desarrollo de nanosistemas basados en moléculas de origen biológico para la monitorización y tratamiento de infecciones bacterianas), se llevó a cabo en el Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza, España, en el seno del grupo de investigación de Materiales Avanzados en Biomedicina (AMiB). La investigación y el trabajo experimental se llevaron a cabo en el Centro de Investigación Biomédica de Aragón (CIBA) y en el Instituto de Nanociencia y Materiales de Aragón (INMA). Además, parte de la investigación se realizó en una estancia predoctoral de 7 meses en el grupo de investigación INSERM U1070 ¿Pharmacology of Antimicrobial Agents and Antibiotic Resistance¿ de la Universidad de Poitiers (Francia). Los estudios doctorales y la investigación realizada recibieron el respaldo de una beca predoctoral FPI financiada por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad de España (CTQ2017-84473-R).<br />En respuesta al constante aumento de la resistencia bacteriana y la creciente ineficacia de los antibióticos actuales, una parte significativa de la investigación contemporánea se dedica en exclusividad a desarrollar nuevas terapias antimicrobianas. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis fue explorar el potencial de una selección de moléculas de origen natural con propiedades antimicrobianas como alternativa a los antibióticos tradicionales. Esta investigación se centró en la encapsulación de estas moléculas en formulaciones nanoestructuradas y en su evaluación para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Los antimicrobianos seleccionados, tanto en sus formas libres como encapsuladas, se evaluaron en diversos escenarios, incluyendo modelos in vitro de cultivos planctónicos y biofilms bacterianos, modelos de infección intracelular en células eucariotas, y estudios in vivo empleando un modelo murino de herida tópica infectada.<br />El segundo objetivo de esta tesis fue desarrollar métodos efectivos para la detección y monitorización de bacterias patógenas en los modelos experimentales. Se utilizaron cepas bacterianas fluorescentes y bioluminiscentes para extraer información sobre la dinámica de crecimiento bacteriano y la eficacia de los tratamientos. Este esfuerzo culminó en el desarrollo de un biosensor que, haciendo uso de las propiedades ópticas únicas de las nanopartículas de oro, permitió la detección, selección y cuantificación de bacterias en distintas muestras de origen biológico.<br />La presente tesis se organiza en varios capítulos, cada uno de los cuales aborda una sección distinta del trabajo realizado:<br />En el Capítulo I, se desarrolla una introducción general, presentando la temática y el contexto en el que se enmarca la tesis. Se introducen varios aspectos clave, comenzando con un análisis del estado del arte de las infecciones bacterianas. A continuación, se profundiza en el creciente problema de las resistencias a los antibióticos, destacando sus posibles alternativas. Por último, se discute la importancia de los sistemas de administración de fármacos y el campo emergente de la nanotecnología, el cual desarrolla aplicaciones prometedoras en el contexto del tratamiento de infecciones bacterianas.<br />El Capítulo II presenta un estudio sobre los efectos bactericidas y antibiofilm de dos terpenos naturales con actividad antimicrobiana: el timol y el farnesol. Estos compuestos se evaluaron tanto de forma individual como en combinación con el antiséptico clorhexidina en experimentos in vitro e in vivo. Con el objetivo de mejorar su eficacia y su aplicabilidad en la práctica clínica, se encapsuló el timol en Eudragit® S100 (copolímero aniónico sintético), con el fin de desarrollar un apósito antimicrobiano. Por otro lado, el farnesol se encapsuló en micelas lipídicas. Los estudios in vitro revelaron una mejora significativa en la eficacia antibacteriana cuando estos compuestos se utilizaron en combinación comparado con su uso de forma individual. Los estudios in vivo, utilizando un modelo murino de herida infectada, validaron los efectos bactericidas superiores de los tratamientos combinados propuestos frente a la monoterapia. La progresión de la infección y la evaluación de los resultados del tratamiento antimicrobiano se monitorearon continuamente en tiempo real mediante el uso de la cepa de S. aureus bioluminiscente Xen36. Los resultados de este capítulo se incluyen en el artículo recientemente publicado titulado "Real-time in vivo monitoring of the antimicrobial action of combination therapies in the management of infected topical wounds" (Landa, G.; Miranda-Calderón, L.G.; Gómez, A.; Pérez, M.; Sebastián, V.; Arruebo, M.; Lamarche, I.; Tewes, F.; Irusta, S.; Mendoza, G. International Journal of Pharmaceutics, 2023, Volume 646, 123502, https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2023.123502).<br />El Capítulo III aborda el desarrollo de un modelo in vitro de biofilms polimicrobianos formados por S. aureus y P. aeruginosa. En este estudio se destaca cómo las condiciones iniciales de las bacterias en co-cultivo influyen en la cinética de crecimiento, y como P. aeruginosa afecta a la proliferación y metabolismo de S. aureus. Una vez establecido el modelo experimental, se procedió a comparar la actividad antimicrobiana del timol y de la clorhexidina frente a ambas especies, tanto en estado planctónico como en biofilms individuales y polimicrobianos. En este contexto, se observó una menor toxicidad de la clorhexidina y del timol sobre S. aureus cuando se encontraba en el biofilm polimicrobiano. Este fenómeno se atribuyó a dos factores fundamentales: la formación de un biofilm mixto de mayor biomasa y grosor que los formados exclusivamente por S. aureus o P. aeruginosa, y una notable reducción en la actividad metabólica de S. aureus inducida por la presencia de moléculas secretadas por P. aeruginosa. Los resultados de este capítulo se incluyen en un artículo científico que será enviado próximamente para su publicación, con el título "Impact of mixed Staphylococcus aureus-Pseudomonas aeruginosa biofilms formation on resistance to antimicrobial treatment of chronically infected wounds".<br />El Capítulo IV se centra en el desarrollo de partículas poliméricas aerosolizables cargadas con colistina, explorando cuatro metodologías diferentes para su síntesis. Estas técnicas incluyeron la síntesis de nanopartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) mediante el método de evaporación de solvente en emulsión simple, la encapsulación mediante nanoprecipitación con solventes miscibles utilizando PLGA-polietilenglicol (PEG), la coacervación de colistina en hidroxipropil metilcelulosa (HPMC) utilizando el método de precipitación en solventes no-miscibles y, por último, la encapsulación de colistina en micropartículas de PLGA mediante la técnica del electrosprayado. La metodología de mayor éxito fue la de precipitación en solventes no-miscibles, logrando una carga del fármaco muy alta (55 % del peso de las partículas), y produciendo partículas con propiedades aerodinámicas adecuadas (3-5 ¿m) para su potencial administración pulmonar. Los ensayos in vitro revelaron una liberación rápida de la colistina en esta formulación. Además, estas partículas demostraron mejorar la eficacia antimicrobiana de la colistina en un modelo de biofilm de P. aeruginosa PAO1, en comparación con dosis equivalentes del fármaco libre. Los resultados de este capítulo se incluyen en el artículo publicado titulado "Colistin-loaded aerosolizable particles for the treatment of bacterial respiratory infections" (Landa, G.; Alejo, T.; Sauzet, T.; Laroche, J.; Sebastian, V.; Tewes, F.; Arruebo, M. International Journal of Pharmaceutics, 2023, Volumen 635, 122732, https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2023.122732)<br />El Capítulo V introduce una nueva formulación antimicrobiana mediante la encapsulación de lisostafina (LYS), una bacteriocina antiestafilocócica, en nanopartículas de PLGA. En este trabajo se evalúa la actividad antimicrobiana tanto de LYS libre como de las nanopartículas de PLGA cargadas con LYS contra diferentes cepas de S. aureus en estado planctónico, en biofilms, y en un modelo de infección intracelular. Se empleó una cepa de S. aureus que expresaba GFP para facilitar el análisis y la adquisición de imágenes mediante microscopía confocal. Los resultados evidenciaron una disminución significativa en la viabilidad de las bacterias, tanto en estado planctónico como en forma sésil, y en ocasiones, lograron su erradicación total. En un modelo de infección intracelular de células eucariotas in vitro, la formulación de LYS encapsulada demostró mayor eficacia en comparación con el tratamiento de la bacteriocina libre. El contenido de este capítulo se incluye en el artículo pendiente de publicación titulado "PLGA nanoparticle-encapsulated lysostaphin for the targeted treatment of Staphylococcus aureus Infections" (Landa, G.; Aguerri, L.; Irusta, S.; Mendoza, G.; y Arruebo, M. Journal of Colloid and Interface Science. En revisión.)<br />El Capítulo VI detalla el desarrollo de un rápido y sencillo sensor óptico de bacterias. Este sistema utiliza nanopartículas de oro funcionalizadas con ácido siálico. Debido a la capacidad de las bacterias patógenas para integrar ácido siálico exógeno, se observó como la acción de éstas causaba la agregación de las nanopartículas de oro. Esta agregación provocaba un cambio en la resonancia de plasmón superficial y en la alteración del espectro óptico de las nanopartículas. Este sistema permitió la detección selectiva de bacterias, pudiendo discriminar entre Gram-negativas (P. aeruginosa ATCC 15442) y Gram-positivas (S. aureus ATCC 25923), así como entre una cepa de S. aureus wild type y una resistente a la meticilina (MRSA USA300). La discriminación de patógenos bacterianos se evaluó en diferentes medios, incluyendo agua, dos disoluciones tampón independientes, medios de cultivo bacteriano, suero y orina. Se precisó de una presencia bacteriana elevada en las muestras para proporcionar una identificación óptica estadísticamente significativa de patógenos en suero humano, mientras que no fue posible detectar la presencia de bacterias a niveles clínicamente relevantes en la orina. El contenido de este capítulo se ha adaptado del artículo publicado titulado "Selective point-of-care detection of pathogenic bacteria using sialic acid functionalized gold nanoparticles" (Landa, G.; Miranda-Calderón, L.G.; Sebastián, V.; Irusta, S.; Mendoza, G.; Arruebo, M. Talanta, 2021, Volume 234, 122644, https://doi.org/10.1016/j.talanta.2021.122644).<br />El Capítulo VII resume las conclusiones más relevantes obtenidas durante esta tesis doctoral. <br />
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000135526 521__ $$97103$$aPrograma de Doctorado en Ingeniería Química y del Medio Ambiente
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000135526 692__ $$aGarantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades
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000135526 700__ $$aMendoza Cantos, Gracia María$$edir.
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