000135880 001__ 135880 000135880 005__ 20240626125838.0 000135880 037__ $$aTESIS-2024-278 000135880 041__ $$aspa 000135880 1001_ $$aBenedí Visiedo, Andrea 000135880 24500 $$aMiméticos bh3 e inhibidores de aurora quinasa y de hsp90: estudio de su mecanismo de acción y búsqueda de combinaciones potencialmente sinérgicas en células de tumores sólidos y de mieloma múltiple 000135880 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad$$c2024 000135880 300__ $$a440 000135880 4900_ $$aTesis de la Universidad de Zaragoza$$v2024-270$$x2254-7606 000135880 500__ $$aPresentado: 19 04 2024 000135880 502__ $$aTesis-Univ. Zaragoza, , 2024$$bZaragoza, Universidad de Zaragoza$$c2024 000135880 506__ $$aby-nc$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/es 000135880 520__ $$aEl cáncer constituye un problema de salud a nivel mundial, con millones de decesos al año. Pese a que los avances conseguidos en las últimas décadas en el ámbito terapéutico han conseguido mejorar la supervivencia y calidad de vida de los pacientes, hoy en día todavía no existe una cura, por lo que es necesario explorar nuevas estrategias terapéuticas más eficaces y personalizadas. Las proteínas de la familia Bcl-2, las quinasas mitóticas de la familia Aurora y las proteínas de choque térmico como la chaperona Hsp90 se han erigido como potenciales dianas terapéuticas dada su frecuente sobreexpresión en las células tumorales y su contribución a las señas de identidad del cáncer. Esto ha favorecido el desarrollo de compuestos dirigidos contra cada una de estas familias de proteínas: los miméticos BH3, que neutralizan a los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 y activan la respuesta apoptótica; los inhibidores de Aurora quinasa, que provocan fallos en la mitosis y la citoquinesis; y los inhibidores de Hsp90, que impiden la estabilización y activación de multitud de proteínas cliente, incluidas oncoproteínas. Por todo ello, en este trabajo se ha pretendido profundizar en el estudio del mecanismo de acción de estas familias de inhibidores y se ha evaluado su potencial antitumoral como agentes únicos o combinados en un panel de ocho líneas celulares tumorales establecidas: cinco de mieloma múltiple (NCI-H929, MM.1S, U266, RPMI 8226 y OPM-2), una de cáncer de pulmón (A549), otra de cáncer de colon (HCT-116) y otra de cáncer pancreático (MIA PaCa-2).<br />Los resultados obtenidos revelan que los miméticos BH3 ABT-737 (inhibidor de Bcl-2/Bcl-XL/Bcl-w), ABT-199 (antagonista de Bcl-2), A-1155463 (inhibidor de Bcl-XL) y S63845 (inhibidor de Mcl-1) despliegan una actividad citotóxica variable en las tres líneas celulares de tumores sólidos y son más eficaces activando la vía autofágica en las células A549 que en las células de mieloma múltiple. Curiosamente, estos compuestos no modifican de forma significativa el perfil de expresión de la mayoría de las proteínas de la familia Bcl-2 evaluadas en las células de mieloma, exceptuando la sobreexpresión de Mcl-1 después del tratamiento con su antagonista y la caída generalizada de PUMA tras la acción de los inhibidores en casi todas las líneas celulares. Además, se ha confirmado que los miméticos BH3 actúan únicamente a través de la vía intrínseca de la apoptosis, aunque la participación de Bim en este proceso no es especialmente relevante en las células de mieloma, salvo en el caso de S63845 y A-1155463, este último solo para las células OPM-2. Por lo tanto, es posible que otras proteínas solo-BH3 estén implicadas en dicho mecanismo apoptótico. Además, los resultados indican que la sobreexpresión de Bcl-XL y Mcl-1 actúa como mecanismo de resistencia frente a los inhibidores selectivos de cada proteína anti-apoptótica.<br />Por otro lado, alisertib (inhibidor de Aurora A) y barasertib (inhibidor de Aurora B) exhiben potencial citostático y citotóxico en las células de mieloma y ambos efectos son mayores a largo plazo. La acumulación de ciclina B1 hallada tras la acción de alisertib indica que este compuesto provoca un arresto mitótico prolongado y, en consecuencia, se activa la catástrofe mitótica, mientras que niveles más bajos de esta proteína después del tratamiento con barasertib se asocian con una parada transitoria en G2/M que las células evaden a través del deslizamiento mitótico. En estos casos, los posibles destinos celulares son la muerte, la entrada en un estado de senescencia o la inducción de poliploidía. De hecho, los resultados confirman que alisertib y barasertib conducen a estos tres destinos finales en todas las líneas celulares de mieloma, lo que reafirma la heterogeneidad en la respuesta a un mismo tratamiento entre líneas celulares e incluso dentro de un mismo cultivo, descrita en otros estudios. No obstante, alisertib posee mayor potencial citotóxico, mientras que barasertib es un inductor de poliploidía más potente. Además, barasertib también induce senescencia en células de tumores sólidos, como se ha comprobado en células tumorales de páncreas en este estudio. Por otro lado, también se ha observado que los inhibidores de Aurora quinasa son capaces de inducir autofagia de manera más eficaz en las células de cáncer de pulmón que en las de mieloma múltiple. <br />En cuanto a su efecto citotóxico, alisertib ha mostrado dos perfiles de toxicidad distintos en varias líneas celulares, lo que sugiere que este inhibidor posee dos mecanismos de acción distintos: uno a dosis bajas en el que inhibiría exclusivamente a Aurora A y otro a dosis altas en el que también bloquearía a Aurora B, algo que ya ha sido propuesto por otros autores. En cualquier caso, los resultados obtenidos indican que ambos inhibidores inducen la caída del potencial mitocondrial y la liberación del citocromo c, eventos que también se producirían en respuesta a alisertib a dosis bajas incluso cuando la ruta apoptótica mitocondrial se encuentra bloqueada. Sin embargo, ambos compuestos provocan un incremento de la expresión de Mcl-1 y/o Bcl-2, así como un aumento o reducción de los niveles de PUMA en función de la línea celular y/o el tratamiento aplicado. Asimismo, se determinó que Bim está implicada en la acción citotóxica de alisertib en las células U266 y en las OPM-2 cuando estas se sometían a exposiciones prolongadas. Además, se encontró que la sobreexpresión de Bcl-XL y/o Mcl-1 otorga resistencia frente a docetaxel y alisertib, pero no frente a vincristina, y se concluyó que algunos antimitóticos activan mecanismos de muerte independientes de Bax y Bak. Finalmente, se determinó que la implicación de las caspasas en la muerte ocasionada por alisertib y barasertib depende de la línea celular y que su contribución es mayor cuando alisertib se utiliza en el rango nanomolar y la vía apoptótica mitocondrial se encuentra inhibida.<br />Un análisis más exhaustivo del efecto de los inhibidores de Aurora quinasa a nivel mitocondrial indica que alisertib y barasertib a dosis altas provocan la hiperpolarización de las mitocondrias en las células RPMI 8226. Además, ambos compuestos incrementan la masa mitocondrial y la producción de ROS mitocondriales en todas las células de mieloma, incluso teniendo en cuenta que ambos aumentan el tamaño celular. Los resultados obtenidos con células leucémicas desprovistas de DNA mitocondrial sugieren que los ROS mitocondriales están implicados en la toxicidad asociada a ambos inhibidores. Sin embargo, los inhibidores metabólicos DCA (que inhibe la glucólisis y fomenta el uso del sistema OXPHOS) y metformina (inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria) no afectan de manera uniforme a la producción de ROS mitocondriales en respuesta a los inhibidores de Aurora quinasa. Por otro lado, se consideró que los ROS totales contribuyen de manera parcial a la acción citotóxica de alisertib y barasertib en algunas líneas celulares.<br />Por su parte, los inhibidores de Hsp90 17-AAG (tanespimicina) y KW-2478 despliegan una toxicidad mayor en las células de mieloma que en las células de cáncer de pulmón, siendo las más sensibles las células MM.1S. Además, a partir de estudios con células deficientes en Bax y Bak se dedujo que estos compuestos activan las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis y otros mecanismos de muerte alternativos. Por otro lado, en las células A549 se observó que ambos inhibidores inducen la parada en mitosis, pero no conducen a un estado de senescencia.<br />Finalmente, en cuanto a las combinaciones evaluadas, la combinación simultánea de miméticos BH3 y fármacos antimitóticos, incluidos alisertib y barasertib, se muestra más efectiva en células de tumores sólidos que de mieloma múltiple, siendo las combinaciones más sinérgicas aquellas que se producen en las células A549 cuando se inhibe Bcl-XL. No obstante, si la inhibición de las proteínas Aurora y las proteínas anti-apoptóticas se produce de manera secuencial en las células de mieloma NCI-H929, MM.1S y U266, se induce una modesta sinergia. Además, los resultados indican que los miméticos BH3 reducen la viabilidad de las células MIA PaCa-2 senescentes, mientras que ABT-737 y A-1155463 exhiben actividad senolítica en las células A549 y la muerte inducida es parcialmente dependiente de caspasas cuando se inhibe específicamente Bcl-XL. En cuanto a la combinación simultánea de los miméticos BH3 y los inhibidores de Hsp90, esta se revela sinérgica en las células A549, especialmente cuando se inhibe Mcl-1, y en las líneas celulares de mieloma NCI-H929, MM.1S y U266. En cambio, si alisertib y barasertib actúan conjuntamente se induce un efecto antagónico en la mayoría de las líneas celulares de mieloma. Por otro lado, la combinación secuencial de alisertib/barasertib y panobinostat (inhibidor de histona deacetilasas), induce un efecto sinérgico en algunas líneas celulares, siendo especialmente llamativo el observado en las células NCI-H929 cuando se utilizan dosis altas de alisertib.<br /> 000135880 520__ $$a<br /> 000135880 521__ $$97073$$aPrograma de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular 000135880 540__ $$9info:eu-repo/semantics/openAccess 000135880 6531_ $$abiología celular 000135880 6531_ $$abioquímica 000135880 6531_ $$aoncología 000135880 691__ $$a0 000135880 692__ $$a 000135880 700__ $$aMarzo Rubio, Isabel $$edir. 000135880 700__ $$aNaval Iraberri, José Javier $$edir. 000135880 7102_ $$aUniversidad de Zaragoza$$b 000135880 830__ $$9485 000135880 8560_ $$fcdeurop@unizar.es 000135880 8564_ $$s14582558$$uhttps://zaguan.unizar.es/record/135880/files/TESIS-2024-278.pdf$$zinfo:eu-repo/date/embargoEnd/2025-04-19 000135880 909CO $$ooai:zaguan.unizar.es:135880$$pdriver 000135880 909co $$ptesis 000135880 9102_ $$aCiencias$$b 000135880 980__ $$aTESIS