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000151576 005__ 20251123074715.0
000151576 037__ $$aTESIS-2025-079
000151576 041__ $$aspa
000151576 1001_ $$aBaselga Lahoz, Marta
000151576 24500 $$aDesarrollo de vectores nano y microparticulados para el tatuaje del ganglio linfático centinela en pacientes con cáncer de mama quimioterapia neoadyuvante
000151576 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad$$c2024
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000151576 4900_ $$aTesis de la Universidad de Zaragoza$$v2025-78$$x2254-7606
000151576 500__ $$aPresentado: 22 11 2024
000151576 502__ $$aTesis-Univ. Zaragoza, , 2024$$bZaragoza, Universidad de Zaragoza$$c2024
000151576 506__ $$aby-nc$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/es
000151576 520__ $$aEn cáncer de mama, la metástasis en ganglios linfáticos axilares es uno de los indicadores pronósticos de mayor relevancia clínica. La diseminación más frecuente ocurre a través de los ganglios axilares homolaterales, siendo el estadiaje ganglionar indispensable para la estadificación del tumor y la elección de tratamiento. Históricamente, la linfadenectomía axilar (LA) constituía el procedimiento estándar para el estadiaje axilar. Sin embargo, en las últimas décadas la LA se ha sustituido por técnicas menos invasivas como la biopsia selectiva del ganglio centinela (BSGC), que consiste en la extirpación individual del ganglio linfático centinela (GC). El GC recibe de forma directa y en primer lugar el drenaje linfático desde la lesión tumoral, por lo que, si el GC no muestra afectación metastática, el resto de los ganglios axilares probablemente permanecen libres de enfermedad. La probabilidad de diseminación preferente en ganglios no centinela es inferior al 0.1 %, por lo que la BSGC ha sustituido la LA para la estadificación del GC, reduciendo la morbilidad de la intervención. La detección del GC se basa en la inyección de radiotrazadores, que migran por via linfática, al igual que las células tumorales, hasta el primer ganglio regional, donde se acumulan temporalmente antes de migrar al resto de los ganglios regionales. En las pacientes que han recibido quimioterapia neoadyuvante (QTNA), las vías de drenaje linfático resultan modificadas y los GC pueden reducir su tamaño como consecuencia del tratamiento. Estas pacientes presentan mayor dificultad para la identificación del GC respecto a las pacientes que no son tratadas, por lo que se hace necesario marcar previamente los ganglios afectados o sospechosos. Para salvar esta limitación, los ganglijos afectados detectados previamente a la QTNA son localizados y marcados. Existen varias técnicas para el marcaje del GC, incluyendo la colocación de clips metálicos radiolúcidos, magnéticos o detectados por sondas radar, el uso de semillas radioactivas y el tatuaje del GC. Este último consiste en la administración de suspensiones de carbono en el tejido ganglionar, consiguiendo una pigmentación negra que permanece en el ganglio hasta la cirugía definitiva y facilita su detección visual en el momento quirúrgico. El tatuaje con suspensiones de carbono ha demostrado ser una técnica simple, asequible y de bajo coste con altas tasas de identificación, además de no interferir durante la evaluación anatomopatológica. Sin embargo, esta técnica es novedosa y todavía no se ha generalizado en las unidades de mama. Además, todavía se requiere de más investigación sobre su permanencia a largo plazo y su posible migración a otros ganglios cercanos para garantizar la seguridad del tratamiento.<br />Con base a lo anterior, el objetivo de esta Tesis fue desarrollar y validar experimentalmente un método de marcaje de GC metastatizados en pacientes con cáncer de mama previa QTNA para la disección axilar dirigida (DAD). Partimos de la hipótesis de que las diferentes variables fisicoquímicas de los vectores de marcaje producen un efecto biológico diferente en el ganglio linfático. Para este fin, optimizamos y caracterizamos 6 tipos de vectores de marcaje para su inoculación directa en los ganglios linfáticos de los animales de experimentación. Utilizamos 10 cerdos White Landrace para la experimentación in vivo; 5 para estudiar los efectos sobre los ganglios linfáticos de la inoculación a corto plazo (1-6 semanas) y otros 5 en los estudios a largo plazo (16 semanas). En los estudios experimentales a corto plazo, se inocularon vectores para comparar el efecto de la encapsulación de nanopartículas de carbono (C-NPs) en partículas poliméricas de ácido (poli(láctico-co-glicólico), PLGA) respecto a la inoculación de C-NPs no encapsuladas, el efecto de la concentración de las partículas en el vector (10 y 20 mg/ml) el efecto de la encapsulación de C-NPs o melanina como elemento colorante y el efecto del tamaño de partícula. Para estudiar esta última variable se encapsularon C-NPs en nano (CS) y micropartículas (CE) de PLGA de tamaños entorno a ~100 nm (nanopartículas, NPs) y a ~1 ¿m (micropartículas, MPs). En los estudios experimentales a largo plazo, además de mantener estas variables, se exploró el uso de otro PLGA base para conseguir una degradación más lenta, así como la coencapsulación de cloroquina (CQ), la cual reduce la internalización de las partículas por parte de los macrófagos, además de las C-NPs. Las NPs de PLGA con C-NPs y melanina encapsulada (M) fueron sintetizadas por emulsión, mientras que las MPs de PLGA-C-NPs se obtuvieron por electrosprayado.<br />En este estudio, se tatuaron un total de 112 ganglios linfáticos en los animales de experimentación con los diversos métodos señalados. Tras los diferentes tiempos de estabulación, se estudiaron diversas variables macro y microscópicas para la comparación de los diferentes vectores. A nivel vel macroscópico se analizaron la facilidad en la identificación intraoperatoria y el área marcada, mientras que a nivel microscópico se estudió la localización de las partículas, el tamaño de los cúmulos formados por los aglomerados de partículas y la intensidad de la reacción inflamatoria. A nivel macroscópico, la tasa de identificación fue del 50-100 % de los ganglios tras 16 semanas dependiendo del tipo de partícula inoculada. No se identificó ninguno de los ganglios marcados con C-NPs no encapsuladas (control). El porcentaje de área marcada fue similar en todos los marcajes (10.3 %), a excepción de las C-NPs no encapsuladas, que solo tatuaron el 2.5 % de la superficie del ganglio. Microscópicamente, en todos los ganglios apareció reacción inflamatoria de tipo cuerpo extraño asociada a la presencia de las partículas, caracterizado por la presencia de macrófagos y células gigantes multinucleadas. En ocasiones, además, se encontraron pequeños focos necróticos, especialmente en los ganglios marcados con vectores basados en melanina. En los estudios ultraestructurales, encontramos que los macrófagos fagocitaron y aislaron las partículas administradas desde la primera semana tras la inoculación. Tras su internalización en fagosomas en un intento por degradar las partículas, tanto las C-NPs como los fragmentos de melanina cristalizada rompen la membrana de los fagosomas, derramando las hidrolasas lisosomales al citoplasma y produciendo la lisis celular. En consecuencia, nuevos macrófagos fagocitan los restos celulares y de partículas presentes en el medio extracelular, y así sucesivamente hasta las 16 semanas estudiadas. Además, estudiamos secuencialmente por microscopía electrónica la migración transendotelial transcelular como un mecanismo asociado a la reacción inflamatoria, donde las células inmunitarias circulantes son reclutadas en regiones específicas de los vasos y extravasadas para orquestar una respuesta inmunitaria.<br />los estudios estadísticos de las variables estudiadas, encontramos leves correlaciones positivas entre el área marcada y la extensión de la inflamación (p<0.043), el área marcada y la tasa de identificación (p<0.001), la inflamación y la tasa de identificación (p<0.001), y negativa entre la tasa de identificación y el tamaño de los cúmulos (p<0.044). Además, el tiempo es el factor que más afecta a las variables estudiadas. Comparando las variables en los estudios a corto y largo plazo encontramos una reducción significativa del área marcada (p<0.001), de la facilidad en la identificación (p<0.001), de la extensión de la inflamación (p=0.002) y del tamaño de los cúmulos (p=0.007) conforme aumenta el tiempo. Según el tipo de marcaje (CS, CE y M) se encontraron diferencias en la extensión de la inflamación (p=0.041), siendo las partículas cargadas de melanina las que mayor inflamación desencadenan, y en el tamaño de los cúmulos (p=0.039), siendo también los vectores de melanina los que formaron agregados de partículas más grandes. Finalmente, el tamaño de la partícula en el vector de marcaje (CS y CE) solo mostró diferencias estadísticamente significativas en la extensión de la inflamación (p=0.044), produciendo las partículas más pequeñas (CS) mayor reacción inflamatoria en los estudios a largo plazo. El cambio de PLGA en los estudios a largo plazo solo reportó diferencias significativas en las distribuciones de la variable del tamaño de los cúmulos para ambos grupos, mientras que la coencapsulación de CQ no pareció tener efecto.<br />En conclusión, observamos que la encapsulación de C-NPs en una matriz polimérica no solo aumenta la estabilidad del marcaje en el ganglio a lo largo del tiempo (reduciendo la migración y evitando el marcaje de ganglios secundarios), sino que también reduce la intensidad de la respuesta inflamatoria y mejora la tasa de identificación intraoperatoria tras 4 meses. A nivel clínico, la facilidad de identificación y la reducción de la reacción inflamatoria son las variables más importantes. Nuestros resultados preliminares indican que las nanopartículas (CS) generan mayor reacción inflamatoria que las micropartículas (CE). Aunque a priori se sopesó que la melanina produjera menor citotoxicidad al tratarse de un pigmento endógeno, encontramos que produce mayor reacción inflamatoria y más necrosis en el tejido ganglionar, por lo que las C-NPs son las candidatas más adecuadas. La tasa de identificación fue ligeramente superior en las CE respecto a las CS. Sin embargo, la identificación fue similar en ambas concentraciones (20 versus 10 mg/ml), lo que sugiere que esa dosis de NPs/MPs es suficiente para tatuar los ganglios a largo plazo. Por tanto, según estos estudios preliminares, los vectores de micropartículas de PLGA con C-NPs encapsuladas en su interior parecen ser los candidatos más adecuados para el marcaje del CG, mejorando la técnica actual de tatuaje ganglionar.<br />
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000151576 521__ $$97085$$aPrograma de Doctorado en Medicina
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000151576 6531_ $$acirugía
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000151576 692__ $$aGarantizar una educación de calidad inclusiva y equitativa, y promover las oportunidades de aprendizaje permanente para todos. Alcanzar la igualdad entre los géneros y empoderar a todas las mujeres y niñas. Reducir las desigualdades entre países y dentro de ellos.
000151576 700__ $$aGüemes Sánchez, Antonio$$edir.
000151576 700__ $$aArruebo Gordo, Manuel$$edir.
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