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000151740 1001_ $$aFamulari , Antonino
000151740 24500 $$aEspectroscopia EPR para la Investigación de Biomoléculas Esenciales
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000151740 500__ $$aPresentado: 20 12 2024
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000151740 520__ $$aLas enzimas, biomoléculas altamente eficientes en la catálisis molecular, desempeñan papeles cruciales en las reacciones estructurales y metabólicas de los seres vivos. La reactividad específica que demuestran en los sitios activos, basada en la unión a un sustrato para iniciar las transformaciones químicas, facilita estos procesos. A pesar de su reutilización y eficiencia en condiciones moderadas, las aplicaciones en laboratorio e industria a menudo están limitadas por sus complejas arquitecturas moleculares. Comprender las relaciones entre su estructura y su reactividad podría aclarar cuestiones no resueltas sobre su comportamiento.<br />Entre las diversas técnicas útiles para este fin, la espectroscopia EPR destaca por encima de todas. Es un método ideal para estudiar biomoléculas paramagnéticas debido a su sensibilidad a electrones desapareados, su naturaleza no destructiva, su capacidad para proporcionar información estructural y dinámica detallada, su posibilidad de detectar especies reactivas inestables y las técnicas avanzadas para medir distancias moleculares. Estas características, combinadas con la alta especificidad y adaptabilidad cuando se combina con la técnica del etiquetado de espín, hacen del EPR una herramienta de mucho valor en el campo de la investigación biomolecular.<br />Esta tesis tiene como objetivo estudiar a través de la espectroscopía EPR y profundizar en el conocimiento de enzimas de alto valor añadido, incluyendo tres nuevos citocromos P450, CYP116B5hd, CYP450_1AB y CYP450_3AB, dos metaloenzimas artificiales, FeIII-METP y DR1, y una flavoproteína, hAIF.<br />El entorno electrónico del hierro en el citocromo CYP116B5hd se ha caracterizado en su estado de reposo, proporcionando información estructural detallada sobre su sitio activo. Entre los principales resultados se destaca la identificación de los protones del agua coordinada y del ligando axial cisteína, así como información sobre la geometría del sitio activo y la distribución del espín electrónico durante la inhibición por imidazol, que sirve como modelo para la inhibición de los citocromos P450 por compuestos nitrogenados. El análisis combinado del tensor giromagnético junto con los tensores hiperfinos y cuadrupolares de los núcleos magnéticos acoplados al espín electrónico del hierro ha proporcionado una comprensión detallada de la geometría del sitio activo, incluida la orientación de los orbitales parcialmente ocupados y de los ejes magnéticos que se alinean con los ejes porfirínicos N-Fe-N. La estructura electrónica del hierro parece permanecer inalterada tras la unión del inhibidor imidazol. Se han identificado dos posibles geometrías de coordinación del imidazol axial basadas en la estructure hiperfina del 14N coordinado axialmente. Se calcularon los ángulos entre gx (que se alinea con uno de los ejes N-Fe-N) y la proyección del plano del imidazol sobre el hemo, obteniendo valores de -60° y -25° para cada una de las dos posibilidades.<br />CYP450_1AB y CYP450_3AB son citocromos fundamentales para la degradación de alcanos en los procesos de biorremediación, mediados por Alcanivorax borkumensis SK2, tras los vertidos de petróleo en el mar, sin embargo, estas enzimas nunca se han producido ni caracterizado. En este trabajo, se ha establecido un protocolo para expresar y purificar CYP450_1AB y CYP450_3AB y permitir su caracterización. No obstante, problemas debidos a la inestabilidad proteica y de incorporación del hemo indican que son necesarias mejoras en los protocolos desarrollados.<br />El siguiente subjeto de estudio es el FeIII-METP, una metaloenzima artificial, que es un oligopéptido diseñado como aceptor final en una cadena de electrones artificial activada por luz visible. Su estructura y su alto potencial de reducción son muy similares a los de su análogo natural, la rubredoxina. Esta similitud está apoyada por la caracterización EPR de su entorno electrónico, que se presenta en este trabajo. Además, DR1, una proteína diseñada ¿de novo¿ con un sitio dimérico de cobre para imitar las enzimas polifenoloxidasas que contienen cobre de Tipo 3, ha sido analizada a través de la espectroscopia EPR cuantitativa para evaluar el grado de acoplamiento antiferromagnético entre los dos átomos de cobre en su sitio activo. DR1 mostró un grado significativo de acoplamiento, comparable al de su análogo natural, la tirosinasa.<br />Por último, la hAIF es una flavoproteína multifuncional que juega un papel tanto en el ensamblaje del complejo respiratorio mitocondrial como en la muerte celular programada independiente de caspasas. Cuando es reducida por NADH, hAIF sufre un cambio conformacional en dos regiones específicas: el bucle regulador flexible C-loop y la horquilla ß 190-202. Esta reorganización facilita la dimerización de la proteína y la estabilización de un complejo de transferencia de carga de larga duración, que influye en el equilibrio monómero-dímero y sus interacciones con otras proteínas en las mitocondrias sanas. La hAIF ha sido estudiada utilizando la técnica de etiquetado de espín sitio dirigido para investigar las distancias intra e intermoleculares en su forma dimerizada reducida con el fin de superar las dificultades encontradas para determinar su estructura terciaria completa con métodos convencionales. Los experimentos de CW-EPR y DEER se centraron en seis nuevos mutantes diseñados y producidos, los cuales, tras una serie de análisis biofísicos, revelaron que presentan la misma estructura terciaria que la hAIF nativa. Se desarrolló un modelo del dímero AIF reducido de la proteína citosólica basado en mediciones experimentales de la dinámica de la cadena polipeptídica y en las distribuciones de distancias entre las etiquetas de espín introducidas en la proteína. El modelo, que concuerda bien con los datos, sugiere un conjunto de conformaciones caracterizadas por C-loop altamente flexibles. Estos bucles flexibles tienden a ocupar la hendidura entre los monómeros, lo que indica una posible débil interacción entre los bucles o entre los bucles y los dominios estructurados. Esta interacción podría jugar un papel crucial en la regulación de la actividad o la estabilidad de AIF. Además, las regiones de las distribuciones de distancias no concordantes con este modelo y algunos de los datos dinámicos sugieren que una fracción de la proteína podría tener la horquilla ß 190-202 desenrollada y desplazada hacia el dominio C-terminal del otro monómero, ofreciendo una explicación para las anomalías de distancia observadas en heterodímeros específicos.<br />Los resultados de esta tesis ponen de relieve varias metodologías relacionadas con EPR para el estudio de biomoléculas y ofrecen estrategias prácticas para desvelar sus complejas propiedades electrónicas. Profundizar en el conocimiento de estas proteínas puede allanar el camino para el desarrollo de nuevas vías industriales y terapéuticas.<br />
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000151740 521__ $$97076$$aPrograma de Doctorado en Física
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000151740 691__ $$a3 6 9
000151740 692__ $$aGarantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades. Garantizar la disponibilidad y la gestión sostenible del agua y el saneamiento para todos. Desarrollar infraestructuras resilientes, promover la industrialización inclusiva y sostenible, y fomentar la innovación.
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