152825 20250401114425.0 TAZ-TFG-2024-2354 spa Aladrén Herrer, Celia Interaction of heterozygous mutations in Twinkle helicase and gamma polymerase Interacción de mutaciones heterocigotas en la helicasa Twinkle y la polimerasa gamma Zaragoza Universidad de Zaragoza 2024 by-nc-sa Creative Commons 3.0 http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ La maquinaria de replicación del DNA mitocondrial (mtDNA) está constituida por varias proteínas como polimerasa γ (POLG), las proteínas ligantes de DNA monocatenario (mtSSB), la RNA polimerasa (POLRMT) y la helicasa TWINKLE implicada en el desenrollamiento 5’-3’ del dúplex DNA/DNA. Mutaciones detectadas en la secuencia de TWINKLE se asocian con problemas en la replicación mitocondrial debido al papel que juega en este proceso. Los pacientes con estas mutaciones presentan comúnmente deleciones y depleción del mtDNA además de defectos en la cadena respiratoria. El objetivo del trabajo es caracterizar la mutación E266K para comprobar la presencia de estos efectos.<br />El estudio de E266K se ha realizado mediante sobreexpresión en fibroblastos 15a (Fb15a) y 3646 (Fb3646) de la mutación en heterocigosis usando partículas lentivirales obtenidas tras el clonaje de la forma con la variante E266K y la forma wild type a partir de Fb3646. Su sobreexpresión se determinó tanto a nivel de proteínas con Western blot como de DNA mediante PCR.<br />Para la caracterización del estado del mtDNA se ha recurrido a una PCR no cuantitativa en la que ha sido posible la detección de posibles deleciones y duplicaciones en las regiones próximas a los orígenes de replicación incluido el bucle-D junto con la acumulación de fragmentos lineales, siendo indicativos en ambos casos de deficiencias en la maquinaria de replicación. La depleción del mtDNA se determinó mediante qPCR observándose reducción del número de copias en los Fb3646 con sobreexpresión de la mutación. Finalmente, se estudió la expresión de proteínas de la cadena respiratoria y el replisoma observando reducción de su expresión en los fibroblastos con sobreexpresión. La reducción es más significativa en Fb15a, evidenciando la importancia del fondo genético en los resultados. Estos resultados junto con lo observado en el mtDNA permiten concluir la existencia de efecto de la mutación E266K en la replicación mitocondrial.<br /><br /> Graduado en Biotecnología Derechos regulados por licencia Creative Commons 819840@unizar.es 1355460 http://zaguan.unizar.es/record/152825/files/TAZ-TFG-2024-2354.pdf Memoria (spa) oai:zaguan.unizar.es:152825 driver trabajos-fin-grado 0 Bayona Bafaluy, Pilar dir. Universidad de Zaragoza Bioquímica y Biología Molecular y Celular Bioquímica y Biología Molecular TAZ TFG CIEN 20240610134755.CREATION_DATE deposita:2025-04-01