Zeballos Lema, Nicoll Paulina
López Gallego, Fernando (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Resumen: El desarrollo industrial de nuestra sociedad ha llevado a incrementar exponencialmente la demanda de productos químicos en todos los ámbitos de la vida, desde agricultura, construcción, producción textil o medicina. Sin embargo, junto a esta demanda, se ha incrementado la necesidad de cambiar los clásicos métodos de producción a métodos más sostenibles y respetuosos con el medio ambiente. Así desde principios del siglo XXI se ha buscado evolucionar socio-económicamente pero de forma orientada a no comprometer el futuro de las generaciones con el consumo de materias primas fósiles o el aumento de desechos no degradables. En este contexto, la biocatálisis se ha establecido como un proceso alternativo tanto para la síntesis como para la biodegradación de compuestos de interés gracias a su continuo avance tecnológico.
La biocatálisis utiliza enzimas como herramienta catalítica biológica para la producción de diferentes productos de interés químico o farmacéutico así como para la degradación de desechos o compuestos tóxicos. Existen otros tipos de catalizadores no biológicos que pueden realizar funciones equivalentes, pero que no poseen las ventajas de estos biocatalizadores. Al ser compuestos biológicos, estos catalizadores se forman de forma natural en células, poseen excelente capacidad catalítica, generalmente trabajan en condiciones fisiológicas y con una selectividad exquisita. Otra de sus características es que permiten obtener productos con alto grado de pureza debido a que presentan quimio, regio y estereoselectividad, además de que por su origen natural son renovables y biodegradables.
Debido a este creciente interés industrial y a los grandes avances en ingeniería de proteínas, herramientas computacionales y genéticas se ha ampliado el abanico de sustratos capaces de ser utilizados por las enzimas más allá de sus compuestos naturales. Sin embargo, debido a su origen las enzimas presentan limitaciones al ser aplicadas a procesos industriales como son su baja estabilidad en presencia de disolventes no polares, altas temperaturas o cambios en el pH. Además de su baja recuperación y reutilización tras reacciones ya sean discontinuas o en flujo debido a su alta solubilidad en medios acuosos. Es así como la inmovilización de estos biocatalizadores en soportes sólidos (biocatalizadores heterogéneos) ha surgido como un proceso casi obligatorio para su posible reciclado y uso a nivel industrial. Si bien la inmovilización es de los biocatalizadores es necesaria, hacerlo con una conformación activa y con una orientación apropiada es la clave para lograr biocatalizadores eficientes y competitivos con los actuales.
En esta tesis doctoral se han desarrollado dos nuevas herramientas para la optimización en el proceso de inmovilización de enzimas en materiales sólidos. Por un lado, en sistemas complejos donde más de una enzima es necesaria, ya sea para llevar a cabo la reacción principal o para el reciclaje de los cofactores necesarios para la reacción. Estos sistemas, también llamados sistemas multienzimáticos, normalmente son rutas alternativas a procesos sintéticos tradicionales por etapas, donde se evita el aislamiento de subproductos e intermedios de reacción y, por tanto, aumentan la ecoeficiencia del proceso general. Inspirados en la distribución espacial en procesos multienzimáticos en la naturaleza como en la degradación de la celulosa por el Celulosoma se han diseñado andamios sintéticos de proteínas (iSECel) mediante interacciones cohesina-dockerina. Esta plataforma biológica ha servido para ensamblar diferentes cascadas multienzimáticas en fase sólida. Por un lado, un sistema bi-enzimático para la transformación de alcoholes en aminas donde se estudió la eficiencia de la cascada en inmovilizaciones segregadas vs. la co-inmovilización en el mismo soporte. Por otro lado, un sistema de tres enzimas para la conversión de dioles, donde se estudió el efecto del orden de las enzimas en el andamio sintético, así como del efecto en la limitación de carga de enzima en el primer paso de ensamblaje (Capítulo 3).
Por otro lado, centrándonos en una sola enzima y teniendo como modelo la interacción entre la etiqueta de histidinas y soportes activados con quelatos metálicos, se ha desarrollado un método para el control de la orientación de la enzima en soportes sólidos. Esta técnica se basa en la modificación racional de la superficie de la enzima insertando clúster de histidinas mediante ingeniería de proteínas. Este proceso consta de tres etapas: la primera de análisis in silico de las enzimas modelo, dos alcoholes deshidrogenasas una de Bacillus steareothermophilus (BsADH) y la otra de Thermus Thermophiles (Tt27-HBDH) usando la herramienta computacional COREX/Best. La segunda etapa de desarrollo de las variantes con clústeres de histidina y el cribado de las mismas en diferentes soportes porosos activados con cuatro diferentes metales. La tercera etapa compuesta por el estudio de los efectos en el biocatalizador final de los mejores candidatos con respecto a la misma enzima con etiqueta de histidina (Capítulo 4).
Finalmente, en el último capítulo experimental (Capítulo 5), se estudió el efecto de la orientación y la distancia de inmovilización en soportes no-porosos, donde problemas de difusión interna desaparecen. En este caso se utilizaron nanopartículas magnéticas las cuales, por un lado, incrementan la capacidad de carga de la enzima debido al tamaño y por otro debido a las propiedades intrínsecas al magnetismo pueden tener innovadoras salidas como la hipertermia localizada. Además de demostrar que la orientación afecta a los parámetros cinéticos y termodinámicos de los biocatalizadores.
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Enzyme immobilization is usually one of the unwritten requirements to enable biocatalysts to play a relevant role in developing new and more sustainable chemical manufacturing routes. To obtain an efficient biocatalyst for this purpose, enzyme immobilization is a key enabling technology. Certain factors, such as the correct orientation of the immobilized enzymes or the enzymes spatial distribution across the carrier surface influence the activity and stability of the resulting heterogeneous biocatalyst. Although many immobilization techniques have been reported throughout the last decades, only a few ones allow enzyme orientation and spatial distribution control. Typically, the insertion of target groups at the N- or C-terminal is used for this goal, limiting the possible orientations of the immobilized enzymes. Considering the widely described and highly selective interaction between histidine tags and divalent metal chelates to attach the enzymes to carriers, we developed several surface histidine cluster variants to control the enzyme orientation beyond the N- or C- terminus. The strategy was tested for two multimeric alcohol dehydrogenase enzymes after a previous rational analysis of the enzyme surface in silico using COREX/Best algorithm. The variants developed were tested on different porous carriers activated with different materials and metal densities. The best candidates were extensively studied using spectrophotometrically, fluorescence microscopy, and proteomic techniques. Additionally, to evaluate the potential of this approach, these candidates were also tested on non-porous nanocarriers such as magnetic nanoparticles.
On the other hand, inspired by the natural organization of the hydrolytic enzymes in the wild cellulosome, we developed synthetic scaffolds using the highest affinity protein-protein interaction between the Cohesin and Dockerin domains. Based on this concept, different immobilized scaffolded enzymatic cellulosome (iSECel) systems were developed to control the spatial distribution of the different multi-enzymatic processes. The performance of the biocatalysts reflects the effect of integrating all the enzymes needed for complete biotransformation in the same carrier, as well as the position of one relative to the other.
The work developed here provides new tools for optimizing new heterogeneous biocatalysts, whether composed of a single enzyme or multiple enzymes, opening a new path for the rational control of enzyme orientation and their spatial organization.
Resumen (otro idioma):
La biocatálisis utiliza enzimas como herramienta catalítica biológica para la producción de diferentes productos de interés químico o farmacéutico así como para la degradación de desechos o compuestos tóxicos. Existen otros tipos de catalizadores no biológicos que pueden realizar funciones equivalentes, pero que no poseen las ventajas de estos biocatalizadores. Al ser compuestos biológicos, estos catalizadores se forman de forma natural en células, poseen excelente capacidad catalítica, generalmente trabajan en condiciones fisiológicas y con una selectividad exquisita. Otra de sus características es que permiten obtener productos con alto grado de pureza debido a que presentan quimio, regio y estereoselectividad, además de que por su origen natural son renovables y biodegradables.
Debido a este creciente interés industrial y a los grandes avances en ingeniería de proteínas, herramientas computacionales y genéticas se ha ampliado el abanico de sustratos capaces de ser utilizados por las enzimas más allá de sus compuestos naturales. Sin embargo, debido a su origen las enzimas presentan limitaciones al ser aplicadas a procesos industriales como son su baja estabilidad en presencia de disolventes no polares, altas temperaturas o cambios en el pH. Además de su baja recuperación y reutilización tras reacciones ya sean discontinuas o en flujo debido a su alta solubilidad en medios acuosos. Es así como la inmovilización de estos biocatalizadores en soportes sólidos (biocatalizadores heterogéneos) ha surgido como un proceso casi obligatorio para su posible reciclado y uso a nivel industrial. Si bien la inmovilización es de los biocatalizadores es necesaria, hacerlo con una conformación activa y con una orientación apropiada es la clave para lograr biocatalizadores eficientes y competitivos con los actuales.
En esta tesis doctoral se han desarrollado dos nuevas herramientas para la optimización en el proceso de inmovilización de enzimas en materiales sólidos. Por un lado, en sistemas complejos donde más de una enzima es necesaria, ya sea para llevar a cabo la reacción principal o para el reciclaje de los cofactores necesarios para la reacción. Estos sistemas, también llamados sistemas multienzimáticos, normalmente son rutas alternativas a procesos sintéticos tradicionales por etapas, donde se evita el aislamiento de subproductos e intermedios de reacción y, por tanto, aumentan la ecoeficiencia del proceso general. Inspirados en la distribución espacial en procesos multienzimáticos en la naturaleza como en la degradación de la celulosa por el Celulosoma se han diseñado andamios sintéticos de proteínas (iSECel) mediante interacciones cohesina-dockerina. Esta plataforma biológica ha servido para ensamblar diferentes cascadas multienzimáticas en fase sólida. Por un lado, un sistema bi-enzimático para la transformación de alcoholes en aminas donde se estudió la eficiencia de la cascada en inmovilizaciones segregadas vs. la co-inmovilización en el mismo soporte. Por otro lado, un sistema de tres enzimas para la conversión de dioles, donde se estudió el efecto del orden de las enzimas en el andamio sintético, así como del efecto en la limitación de carga de enzima en el primer paso de ensamblaje (Capítulo 3).
Por otro lado, centrándonos en una sola enzima y teniendo como modelo la interacción entre la etiqueta de histidinas y soportes activados con quelatos metálicos, se ha desarrollado un método para el control de la orientación de la enzima en soportes sólidos. Esta técnica se basa en la modificación racional de la superficie de la enzima insertando clúster de histidinas mediante ingeniería de proteínas. Este proceso consta de tres etapas: la primera de análisis in silico de las enzimas modelo, dos alcoholes deshidrogenasas una de Bacillus steareothermophilus (BsADH) y la otra de Thermus Thermophiles (Tt27-HBDH) usando la herramienta computacional COREX/Best. La segunda etapa de desarrollo de las variantes con clústeres de histidina y el cribado de las mismas en diferentes soportes porosos activados con cuatro diferentes metales. La tercera etapa compuesta por el estudio de los efectos en el biocatalizador final de los mejores candidatos con respecto a la misma enzima con etiqueta de histidina (Capítulo 4).
Finalmente, en el último capítulo experimental (Capítulo 5), se estudió el efecto de la orientación y la distancia de inmovilización en soportes no-porosos, donde problemas de difusión interna desaparecen. En este caso se utilizaron nanopartículas magnéticas las cuales, por un lado, incrementan la capacidad de carga de la enzima debido al tamaño y por otro debido a las propiedades intrínsecas al magnetismo pueden tener innovadoras salidas como la hipertermia localizada. Además de demostrar que la orientación afecta a los parámetros cinéticos y termodinámicos de los biocatalizadores.
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Enzyme immobilization is usually one of the unwritten requirements to enable biocatalysts to play a relevant role in developing new and more sustainable chemical manufacturing routes. To obtain an efficient biocatalyst for this purpose, enzyme immobilization is a key enabling technology. Certain factors, such as the correct orientation of the immobilized enzymes or the enzymes spatial distribution across the carrier surface influence the activity and stability of the resulting heterogeneous biocatalyst. Although many immobilization techniques have been reported throughout the last decades, only a few ones allow enzyme orientation and spatial distribution control. Typically, the insertion of target groups at the N- or C-terminal is used for this goal, limiting the possible orientations of the immobilized enzymes. Considering the widely described and highly selective interaction between histidine tags and divalent metal chelates to attach the enzymes to carriers, we developed several surface histidine cluster variants to control the enzyme orientation beyond the N- or C- terminus. The strategy was tested for two multimeric alcohol dehydrogenase enzymes after a previous rational analysis of the enzyme surface in silico using COREX/Best algorithm. The variants developed were tested on different porous carriers activated with different materials and metal densities. The best candidates were extensively studied using spectrophotometrically, fluorescence microscopy, and proteomic techniques. Additionally, to evaluate the potential of this approach, these candidates were also tested on non-porous nanocarriers such as magnetic nanoparticles.
On the other hand, inspired by the natural organization of the hydrolytic enzymes in the wild cellulosome, we developed synthetic scaffolds using the highest affinity protein-protein interaction between the Cohesin and Dockerin domains. Based on this concept, different immobilized scaffolded enzymatic cellulosome (iSECel) systems were developed to control the spatial distribution of the different multi-enzymatic processes. The performance of the biocatalysts reflects the effect of integrating all the enzymes needed for complete biotransformation in the same carrier, as well as the position of one relative to the other.
The work developed here provides new tools for optimizing new heterogeneous biocatalysts, whether composed of a single enzyme or multiple enzymes, opening a new path for the rational control of enzyme orientation and their spatial organization.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: bioquímica molecular ; tecnología de catálisis
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 17 05 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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Registro creado el 2025-05-29, última modificación el 2025-05-29
