000162156 001__ 162156 000162156 005__ 20250717111541.0 000162156 037__ $$aTESIS-2025-243 000162156 041__ $$aeng 000162156 1001_ $$aNovo Huerta, Nerea 000162156 24500 $$aThe human Apoptosis Inducing Factor family: from the molecular mechanism of the Apoptosis Inducing Factor and the Apoptosis Inducing Factor–Like to their functional and pathological significance 000162156 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad$$c2023 000162156 300__ $$a341 000162156 4900_ $$aTesis de la Universidad de Zaragoza$$v2025-242$$x2254-7606 000162156 500__ $$aPresentado: 13 07 2023 000162156 502__ $$aTesis-Univ. Zaragoza, , 2023$$bZaragoza, Universidad de Zaragoza$$c2023 000162156 506__ $$aby-nc$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/es 000162156 520__ $$aLa familia del factor inductor de apoptosis (AIF) humana consiste en un grupo de tres flavoenzimas que comparten un dominio oxidorreductasa y la habilidad para inducir muerte celular programada, aunque a través de mecanismos diferentes. AIF es la miembro fundadora y la mejor caracterizada hasta el momento. <br />AIF es una enzima multifunción dependiente de FAD que participa en el ensamblaje de los complejos respiratorios mitocondriales en células sanas, pero que puede también desencadenar la escisión del ADN y el parthanatos en condiciones patológicas. Tras un estímulo apoptótico, AIF es liberada de la mitocondria y posteriormente translocada al núcleo. Ahí puede interactuar con otras proteínas como la endonucleasa ciclofilina A (CypA) y la histona 2AX (H2AX), resultando en la formación de un complejo multiproteico conocido como degradosoma. En el primer capítulo de resultados de esta tesis, evidenciamos el ensamblaje molecular de este complejo, así como los efectos cooperativos que son experimentados por sus componentes proteicos, culminado finalmente en la degradación del ADN genómico en fragmentos grandes. También hemos descubierto que AIF posee actividad nucleasa que es estimulada en presencia de Mg2+ o Ca2+. Tal actividad permite a AIF degradar eficientemente ADN genómico, bien sea por sí misma o en cooperación con CypA. Finalmente, hemos identificado los motivos TopIB y DEK en AIF como responsables de su actividad nucleasa. Estos nuevos descubrimientos señalan, por primera vez, a AIF como una nucleasa capaz de digerir el ADN nuclear en células moribundas, profundizando nuestro conocimiento sobre su papel en la inducción de la apoptosis y abriendo caminos para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.<br />Como se ha indicado anteriormente, AIF presenta un papel esencial en la bioenergética y el metabolismo redox de las mitocondrias en células sanas. AIF dimeriza tras la reducción de su cofactor FAD por la coenzima NADH, provocando la formación de un CTC FADH¿:NAD+ extraordinariamente estable. El equilibrio monómero¿dímero que se establece de esta forma puede ser concebido como un sensor del estado redox mitocondrial en término de los niveles de NADH/NAD+, siendo además arbitrado por la unión alostérica de una segunda molécula no catalítica de NADH. Defectos en AIF dan lugar a disfunciones mayores en la fosforilación oxidativa, resultando en desórdenes patogénicos humanos que cursan con neurodegeneración severa entre otros síntomas considerables. En el segundo capítulo de resultados de esta tesis, hemos llevado a cabo la caracterización biofísica de dos variantes identificadas recientemente y relacionadas con la enfermedad: Met340Thr y Thr141Ile, localizadas en los dominios proteicos dependiente de NADH y dependiente de FAD respectivamente. Para poder elucidar su participación en los fenotipos patológicos reportados, hemos evaluado el impacto de estas sustituciones en la actividad NADH oxidasa, la estabilidad del CTC, la estabilidad general de la proteína y la interacción con parejas biológicas clave.<br />La ayuda que AIF proporciona a las mitocondrias en células sanas para su meticuloso funcionamiento parece originar de su dominio oxidorreductasa y las funciones que este desempeña. Como se ha explicado previamente, el cofactor FAD que posee puede ser reducido por la coenzima NADH, resultando en la dimerización de la proteína y la formación de un CTC FADH¿:NAD+ significativamente estable. El equilibrio monómero¿dímero resultante está además regulado por la unión alostérica del NADHB no catalítico. El triptófano 483 de la AIF humana desempeña un papel fundamental en este proceso, ya que está involucrado en una extensa red de puentes de hidrógeno que estabiliza la conformación del NADHA catalítico mientras simultáneamente se apila entre el anillo isoaloxazina de la flavina y la nicotinamida del NADHB. Esto permite la formación de un complejo catalíticamente competente para la transferencia de hidruro entre el FAD y el NADHA, determinando la baja eficiencia de AIF como una NADH oxidasa. Tres variantes del W483 que podían potencialmente alterar el entorno del anillo isoaloxazina de la flavina (W483G, W483L y W483Y) fueron previamente generadas en nuestro grupo, produciendo efectos notables tanto en la transferencia de hidruro como en las tasas de disociación. Dichas sustituciones quedan caracterizadas en mayor extensión en el tercer capítulo de resultados de esta tesis, demostrando sus implicaciones críticas en la eficiencia y dinámica de la transferencia de hidruro, el potencial redox y la estabilidad termodinámica.<br />Aparte de AIF, la familia AIF humana contiene otra proteína que guarda una considerable similitud con la AIF y que es conocida como factor inductor de apoptosis 3 (AIFL). En contrate con AIF, AIFL es una miembro de la familia proteica AIF para la cual hay disponible una cantidad sorprendentemente escasa de información con respeto tanto a su estructura como a su función. AIFL posee un dominio ferredoxina de tipo Rieske con un clúster Fe¿S que es único en la familia, concibiendo para esta proteína una función potencialmente vital como eliminadora de radicales libres in vivo. Desafortunadamente, ninguna estructura determinada experimentalmente está disponible para AIFL actualmente. Sin embargo, los modelos computacionales de AIFL en su forma completa sugieren que la transferencia de electrones podría teóricamente tener lugar entre sus centros redox, siendo la coenzima NADH la potencial molécula donante. En el cuarto capítulo de resultados de esta tesis, varios experimentos de expresión proteica han sido llevados a cabo en Escherichia coli con la esperanza de purificar la AIFL soluble y activa en homogeneidad, pero no se ha podido observar una expresión soluble significativa ni siquiera tras el cribado de varias cepas y condiciones diferentes. Las dificultades afrontadas aquí pueden ser explicadas por la inhabilidad de AIFL para plegarse adecuadamente mientras está dentro de la célula, lo cual podría ser secundario a una incorporación incorrecta del clúster Fe¿S en el dominio Rieske.<br /> 000162156 520__ $$a<br /> 000162156 521__ $$97073$$aPrograma de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular 000162156 540__ $$9info:eu-repo/semantics/openAccess 000162156 6531_ $$abioquímica molecular 000162156 6531_ $$aproteínas 000162156 6531_ $$abiofísica 000162156 691__ $$a0 000162156 692__ $$a 000162156 700__ $$aMedina Trullenque, María Milagros $$edir. 000162156 700__ $$aFerreira Neila, Patricia $$edir. 000162156 7102_ $$aUniversidad de Zaragoza$$b 000162156 830__ $$9485 000162156 8560_ $$fcdeurop@unizar.es 000162156 8564_ $$s20265594$$uhttps://zaguan.unizar.es/record/162156/files/TESIS-2025-243.pdf$$zTexto completo (eng) 000162156 909CO $$ooai:zaguan.unizar.es:162156$$pdriver 000162156 909co $$ptesis 000162156 9102_ $$aCiencias$$b 000162156 980__ $$aTESIS