Bidooki, Seyed Hesamoddin
de la Osada García, Jesús (dir.) ; de Matos Fernandes, Susana (dir.) ; Navarro Ferrando, María Ángeles (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2025
Resumen: Enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD), anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es inducida por la acumulación de grasa en el hígado. El estrés del retículo endoplasmático (RE), el estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial son elementos necesarios en el desarrollo de la MASLD. La proteína que contiene dominios tiorredoxina tipo 5 (TXNDC5) es un miembro de la familia de las tiorredoxinas y desempeña un papel fundamental como chaperona del RE involucrada en el mantenimiento de la homeostasis celular en condiciones de estrés. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos a través de los cuales TXNDC5 ejerce sus efectos sobre los hepatocitos en condiciones de estrés oxidativo y del RE siguen siendo incompletos. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de TXNDC5 sobre la acción del escuáleno, un antioxidante natural que se encuentra en el aceite de oliva virgen,
administrado a través de varios sistemas de administración de fármacos para mejorar su biodisponibilidad. El escuáleno se encapsulo en nanoparticulas de PLGA y quitosano con el objetivo de mejorar su captación celular en células AML12 (hígado de ratón alfa) y células
AML12 deficientes en TXNDC5 (KO) producidas mediante tecnología CRISPR/Cas9. La caracterización de las nanopartículas mediante microscopia electrónica, dispersión dinámica de la luz, análisis del potencial zeta y cromatografía liquida de alta resolución confirmo la encapsulación eficiente y la inclusión de escuáleno en diferentes concentraciones. La encapsulación de escuáleno en nanopartículas de quitosano demostró una absorción celular significativamente mejorada en comparación con los portadores de fármacos PLGA y etanol.
Esto permite la administración de dosis mas altas, que mejoran la viabilidad de los hepatocitos y reducen los niveles de ROS, compensando eficazmente los efectos adversos de la deficiencia de TXNDC5 en el contexto de la protección contra el estrés de los hepatocitos.
Los ensayos de viabilidad celular mostraron que TXNDC5 tiene un papel importante en la modulación de la viabilidad celular en condiciones de estrés oxidativo y de ER, como lo demuestra el hecho de que el escuáleno redujo eficazmente los ROS en las células AML12
mientras aumentaba los ROS en las células deficientes en TXNDC5. Se observo que el escuáleno mejora la viabilidad celular en condiciones de estrés de ER al disminuir la expresión de marcadores de estrés de ER, incluidos ERN1 y EIF2AK3, e induciendo la expresión de proteínas protectoras como GPx4. Para determinar la función de TXNDC5 en las lineas celulares AML12 y KO, se utilizaron tunicamicina, acido palmitico y tapsigargina como factores de estres. Los resultados de la expresión de proteínas de los marcadores de estrés del RE mas destacados revelaron que, entre ellos, las proteínas ERN1 y EIF2AK3 estaban disminuidas y HSPA5 estaba aumentada. La tunicamicina ha alterado los niveles de proteínas de HSPA5, ERN1 y EIF2AK3 en las celulas KO. El acido palmitico modifico los niveles de proteínas de los sensores de estrés del RE, como ATF6, HSPA5 y EIF2AK3. TXNDC5 interaccionaba con PRDX6 y HSPA9, proteínas involucradas en la regulación redox de la
peroxidación lipídica y el glutation, y con la pérdida de TXNDC5, estas vías tienen actividades reducidas, como se registro por la reducción de la peroxidación lipídica y del glutation. Por lo tanto, la pérdida de TXNDC5 afecto las funciones mitocondriales y altero específicamente los
niveles de ARNm que codifican genes que participan en una respuesta al estrés oxidativo y en el proceso de plegamiento de proteínas.
En conclusión, estos hallazgos muestran que TXNDC5 es un modulador de múltiples vías de señalizacion involucradas en el estrés oxidativo e inducido por ER en los hepatocitos, y que el escualeno, administrado a través de nanopartículas de PLGA y quitosano, previene la acción de estos estreses y apoya su accion protectora por las implicaciones terapeúticas subyacentes para la modulación de TXNDC5 con un sistema de administración de fármacos a dianas para proteger el hígado.
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Metabolic dysfunction¿associated steatotic liver disease (MASLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is induced by fat accumulation within the liver. Endoplasmic reticulum (ER) stress, oxidative stress, and mitochondrial dysfunction are necessary elements in the development of MASLD. Thioredoxin domain-containing 5 (TXNDC5) is a member of the thioredoxin family and plays a pivotal role as an ER chaperone involved in maintaining cellular homeostasis in stress conditions. Nevertheless, the precise molecular mechanisms through which TXNDC5 exerts its effects on hepatocytes under conditions of oxidative and ER stress remain incompletely understood. The objective of this study was to investigate the effects of TXNDC5 on squalene action, a natural antioxidant found in virgin olive oil, delivered through various drug delivery systems to enhance its bioavailability. Squalene was encapsulated in PLGA and chitosan nanoparticles with the aim of enhancing its cellular uptake in AML12 (alpha mouse liver) cells and TXNDC5-deficient AML12 cells (KO) produced by CRISPR/Cas9 technology. Characterization of the nanoparticles by electron microscopy, dynamic light scattering, zeta potential analysis, and high-performance liquid chromatography confirmed efficient encapsulation and inclusion of squalene at different concentrations. The encapsulation of squalene in chitosan nanoparticles demonstrated a significantly enhanced cellular uptake in comparison to the PLGA and ethanol drug carriers. This enables the administration of higher doses, which enhance hepatocyte viability and reduce ROS levels, effectively compensating for the adverse effects of TXNDC5 deficiency in the context of hepatocyte stress protection.
Cell viability assays showed that TXNDC5 has an important role in modulating cell viability under conditions of oxidative and ER stress, as evidenced by the fact that squalene effectively reduced ROS in AML12 cells while increasing ROS in TXNDC5-deficient cells. Squalene was observed to enhance cell viability under conditions of ER stress by decreasing the expression of ER stress markers, including ERN1 and EIF2AK3, and by inducing the expression of protective proteins such as GPx4. To ascertain the function of TXNDC5 in AML12 and KO cell lines, tunicamycin, palmitic acid, and thapsigargin were utilized as stressors. The results from protein expression of the most prominent ER stress markers revealed that among them, the proteins ERN1 and EIF2AK3 were downregulated and HSPA5 was upregulated. Tunicamycin has disrupted the protein levels of HSPA5, ERN1, and EIF2AK3 in KO cells. Palmitic acid modified the protein levels of the ER stress sensors, such as ATF6, HSPA5, and EIF2AK3. TXNDC5 interacted with PRDX6 and HSPA9, proteins involved in the redox regulation of lipid peroxidation and glutathione, and with the loss of TXNDC5, these pathways do have reduced activities, as was recorded by reduced lipid and glutathione peroxidation. Thereby, loss of TXNDC5 impacted mitochondrial functions and specifically disrupted the mRNA levels coding genes that participate in an oxidative stress response and protein folding process.
In conclusion, these findings show that TXNDC5 is a modulator of multiple signaling pathways involved in oxidative and ER-induced stresses in hepatocytes, which squalene, given through PLGA and chitosan nanoparticles, prevents the action of these stresses and supports its protective action by the underlying therapeutic implications for modulation of TXNDC5 with a drug-target delivery system to protect the liver.
Resumen (otro idioma):
administrado a través de varios sistemas de administración de fármacos para mejorar su biodisponibilidad. El escuáleno se encapsulo en nanoparticulas de PLGA y quitosano con el objetivo de mejorar su captación celular en células AML12 (hígado de ratón alfa) y células
AML12 deficientes en TXNDC5 (KO) producidas mediante tecnología CRISPR/Cas9. La caracterización de las nanopartículas mediante microscopia electrónica, dispersión dinámica de la luz, análisis del potencial zeta y cromatografía liquida de alta resolución confirmo la encapsulación eficiente y la inclusión de escuáleno en diferentes concentraciones. La encapsulación de escuáleno en nanopartículas de quitosano demostró una absorción celular significativamente mejorada en comparación con los portadores de fármacos PLGA y etanol.
Esto permite la administración de dosis mas altas, que mejoran la viabilidad de los hepatocitos y reducen los niveles de ROS, compensando eficazmente los efectos adversos de la deficiencia de TXNDC5 en el contexto de la protección contra el estrés de los hepatocitos.
Los ensayos de viabilidad celular mostraron que TXNDC5 tiene un papel importante en la modulación de la viabilidad celular en condiciones de estrés oxidativo y de ER, como lo demuestra el hecho de que el escuáleno redujo eficazmente los ROS en las células AML12
mientras aumentaba los ROS en las células deficientes en TXNDC5. Se observo que el escuáleno mejora la viabilidad celular en condiciones de estrés de ER al disminuir la expresión de marcadores de estrés de ER, incluidos ERN1 y EIF2AK3, e induciendo la expresión de proteínas protectoras como GPx4. Para determinar la función de TXNDC5 en las lineas celulares AML12 y KO, se utilizaron tunicamicina, acido palmitico y tapsigargina como factores de estres. Los resultados de la expresión de proteínas de los marcadores de estrés del RE mas destacados revelaron que, entre ellos, las proteínas ERN1 y EIF2AK3 estaban disminuidas y HSPA5 estaba aumentada. La tunicamicina ha alterado los niveles de proteínas de HSPA5, ERN1 y EIF2AK3 en las celulas KO. El acido palmitico modifico los niveles de proteínas de los sensores de estrés del RE, como ATF6, HSPA5 y EIF2AK3. TXNDC5 interaccionaba con PRDX6 y HSPA9, proteínas involucradas en la regulación redox de la
peroxidación lipídica y el glutation, y con la pérdida de TXNDC5, estas vías tienen actividades reducidas, como se registro por la reducción de la peroxidación lipídica y del glutation. Por lo tanto, la pérdida de TXNDC5 afecto las funciones mitocondriales y altero específicamente los
niveles de ARNm que codifican genes que participan en una respuesta al estrés oxidativo y en el proceso de plegamiento de proteínas.
En conclusión, estos hallazgos muestran que TXNDC5 es un modulador de múltiples vías de señalizacion involucradas en el estrés oxidativo e inducido por ER en los hepatocitos, y que el escualeno, administrado a través de nanopartículas de PLGA y quitosano, previene la acción de estos estreses y apoya su accion protectora por las implicaciones terapeúticas subyacentes para la modulación de TXNDC5 con un sistema de administración de fármacos a dianas para proteger el hígado.
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Metabolic dysfunction¿associated steatotic liver disease (MASLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is induced by fat accumulation within the liver. Endoplasmic reticulum (ER) stress, oxidative stress, and mitochondrial dysfunction are necessary elements in the development of MASLD. Thioredoxin domain-containing 5 (TXNDC5) is a member of the thioredoxin family and plays a pivotal role as an ER chaperone involved in maintaining cellular homeostasis in stress conditions. Nevertheless, the precise molecular mechanisms through which TXNDC5 exerts its effects on hepatocytes under conditions of oxidative and ER stress remain incompletely understood. The objective of this study was to investigate the effects of TXNDC5 on squalene action, a natural antioxidant found in virgin olive oil, delivered through various drug delivery systems to enhance its bioavailability. Squalene was encapsulated in PLGA and chitosan nanoparticles with the aim of enhancing its cellular uptake in AML12 (alpha mouse liver) cells and TXNDC5-deficient AML12 cells (KO) produced by CRISPR/Cas9 technology. Characterization of the nanoparticles by electron microscopy, dynamic light scattering, zeta potential analysis, and high-performance liquid chromatography confirmed efficient encapsulation and inclusion of squalene at different concentrations. The encapsulation of squalene in chitosan nanoparticles demonstrated a significantly enhanced cellular uptake in comparison to the PLGA and ethanol drug carriers. This enables the administration of higher doses, which enhance hepatocyte viability and reduce ROS levels, effectively compensating for the adverse effects of TXNDC5 deficiency in the context of hepatocyte stress protection.
Cell viability assays showed that TXNDC5 has an important role in modulating cell viability under conditions of oxidative and ER stress, as evidenced by the fact that squalene effectively reduced ROS in AML12 cells while increasing ROS in TXNDC5-deficient cells. Squalene was observed to enhance cell viability under conditions of ER stress by decreasing the expression of ER stress markers, including ERN1 and EIF2AK3, and by inducing the expression of protective proteins such as GPx4. To ascertain the function of TXNDC5 in AML12 and KO cell lines, tunicamycin, palmitic acid, and thapsigargin were utilized as stressors. The results from protein expression of the most prominent ER stress markers revealed that among them, the proteins ERN1 and EIF2AK3 were downregulated and HSPA5 was upregulated. Tunicamycin has disrupted the protein levels of HSPA5, ERN1, and EIF2AK3 in KO cells. Palmitic acid modified the protein levels of the ER stress sensors, such as ATF6, HSPA5, and EIF2AK3. TXNDC5 interacted with PRDX6 and HSPA9, proteins involved in the redox regulation of lipid peroxidation and glutathione, and with the loss of TXNDC5, these pathways do have reduced activities, as was recorded by reduced lipid and glutathione peroxidation. Thereby, loss of TXNDC5 impacted mitochondrial functions and specifically disrupted the mRNA levels coding genes that participate in an oxidative stress response and protein folding process.
In conclusion, these findings show that TXNDC5 is a modulator of multiple signaling pathways involved in oxidative and ER-induced stresses in hepatocytes, which squalene, given through PLGA and chitosan nanoparticles, prevents the action of these stresses and supports its protective action by the underlying therapeutic implications for modulation of TXNDC5 with a drug-target delivery system to protect the liver.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: bioquímica ; aceites y grasas vegetales ; biología molecular ; procesos metabólicos
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 09 06 2025
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2025
Aportación del TFG/M a la Sostenibilidad: Garantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades.
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Registro creado el 2025-09-16, última modificación el 2025-09-16
