Virumbrales Muñoz, María
Doblaré Castellano, Manuel (dir.) ; Ochoa Garrido, Ignacio (dir.) ; Fernández Ledesma, Luis José (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2017
Abstract: A pesar de que la incidencia del cáncer está en aumento, sobre todo en los países desarrollados, el desarrollo de nuevos fármacos contra esta enfermedad es cada vez menos efectivo. Para revertir esta tendencia, aparece la necesidad de desarrollar mejores herramientas para reproducir y caracterizar el microentorno tumoral. Una de ellas son modelos in vitro más precisos.
En este contexto, la microfluídica se presenta como una potente alternativa para el desarrollo de estos nuevos modelos in vitro más precisos, que puedan emplearse para un desarrollo y selección de fármacos más racional y efectivo. No obstante, se trata de un conjunto de técnicas poco extendido en los laboratorios de biología molecular. Así, en la presente tesis se desarrollan dos modelos microfluídicos del microentorno tumoral para tumores sólidos, junto a las herramientas necesarias para su caracterización, todo ello de fácil uso para tratar de generalizar la aplicación de los mismos.
En el capítulo 1 se realiza una revisión del estado de la cuestión en lo referente a modelos de cáncer in vitro y su caracterización. En el capítulo 2 se desarrolla un modelo microfluídico de co-cultivo que permite estudiar las interacciones endotelio-tumor, así como la capacidad de penetración y erradicación de células tumorales de nuevos fármacos. En el capítulo 3 se presenta una herramienta para caracterizar los niveles de oxígeno molecular en cualquier punto de un cultivo in vitro 3D. En el capítulo 4 se presenta un modelo de tumor centrado en la generación y caracterización de gradientes biológicos, así como su adaptación a las técnicas tradicionales de biología molecular para el análisis del perfil genético del microentorno tumoral a lo largo del tiempo.
Para generar los sistemas microfluídicos descritos anteriormente, se emplearon dispositivos fabricados mediante distintas técnicas y materiales. En los dispositivos se sembraron distintas poblaciones celulares, intentando así reproducir la estructura y organización de los tejidos biológicos. Mediante diferentes técnicas de microscopía (óptica, fluorescencia, confocal, imagen en tiempo real) y sondas fluorescentes se monitorizó la evolución y comportamiento celular. La caracterización del hidrogel sensible al oxígeno se realizó a través de las técnicas ya citadas, así como espectrofotometría, microscopía de fuerza atómica y electrónica de barrido en condiciones ambientales. Finalmente, la extracción de las células de los hidrogeles se realizó por medio de degradaciones enzimáticas, y la cuantificación de la expresión génica mediante extracción de RNA, retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
La conclusión general de la tesis, es que la utilización de modelos biomiméticos cambia dramáticamente el resultado de los ensayos realizados in vitro, por lo que su uso es necesario para obtener resultados relevantes y trasladables a la clínica. Asimismo, el desarrollo de sistemas biomiméticos in vitro del microentorno tumoral de uso generalizado es posible mediante el desarrollo de dispositivos de fácil uso, así como del establecimiento de métodos robustos de caracterización de los mismos, tanto in situ como “aguas abajo” del establecimiento de los modelos.
Bibliografía:
1. Balkwill FR, Capasso M, Hagemann T (2012) The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci 125: 5591-5596.
2. Junttila MR, de Sauvage FJ (2013) Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature 501: 346-354.
3. Scannell JW, Blanckley A, Boldon H, Warrington B (2012) Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D; efficiency. Nat Rev Drug Discov 11: 191-200.
4. Adriani G, Pavesi A, Tan AT, Bertoletti A, Thiery JP, et al. (2016) Microfluidic models for adoptive cell-mediated cancer immunotherapies. Drug Discov Today 21: 1472-1478.
5. Ayuso JM, Virumbrales-Munoz M, Lacueva A, Lanuza PM, Checa-Chavarria E, et al. (2016) Development and characterization of a microfluidic model of the tumour microenvironment. Sci Rep 6: 36086.
6. Ayuso JM, Monge R, Martínez-González A, Virumbrales-Muñoz M, Llamazares GA, et al. (2017) Glioblastoma on a microfluidic chip: Generating pseudopalisades and enhancing aggressiveness through blood vessel obstruction events. Neuro-Oncology: now230.
Abstract (other lang.):
En este contexto, la microfluídica se presenta como una potente alternativa para el desarrollo de estos nuevos modelos in vitro más precisos, que puedan emplearse para un desarrollo y selección de fármacos más racional y efectivo. No obstante, se trata de un conjunto de técnicas poco extendido en los laboratorios de biología molecular. Así, en la presente tesis se desarrollan dos modelos microfluídicos del microentorno tumoral para tumores sólidos, junto a las herramientas necesarias para su caracterización, todo ello de fácil uso para tratar de generalizar la aplicación de los mismos.
En el capítulo 1 se realiza una revisión del estado de la cuestión en lo referente a modelos de cáncer in vitro y su caracterización. En el capítulo 2 se desarrolla un modelo microfluídico de co-cultivo que permite estudiar las interacciones endotelio-tumor, así como la capacidad de penetración y erradicación de células tumorales de nuevos fármacos. En el capítulo 3 se presenta una herramienta para caracterizar los niveles de oxígeno molecular en cualquier punto de un cultivo in vitro 3D. En el capítulo 4 se presenta un modelo de tumor centrado en la generación y caracterización de gradientes biológicos, así como su adaptación a las técnicas tradicionales de biología molecular para el análisis del perfil genético del microentorno tumoral a lo largo del tiempo.
Para generar los sistemas microfluídicos descritos anteriormente, se emplearon dispositivos fabricados mediante distintas técnicas y materiales. En los dispositivos se sembraron distintas poblaciones celulares, intentando así reproducir la estructura y organización de los tejidos biológicos. Mediante diferentes técnicas de microscopía (óptica, fluorescencia, confocal, imagen en tiempo real) y sondas fluorescentes se monitorizó la evolución y comportamiento celular. La caracterización del hidrogel sensible al oxígeno se realizó a través de las técnicas ya citadas, así como espectrofotometría, microscopía de fuerza atómica y electrónica de barrido en condiciones ambientales. Finalmente, la extracción de las células de los hidrogeles se realizó por medio de degradaciones enzimáticas, y la cuantificación de la expresión génica mediante extracción de RNA, retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
La conclusión general de la tesis, es que la utilización de modelos biomiméticos cambia dramáticamente el resultado de los ensayos realizados in vitro, por lo que su uso es necesario para obtener resultados relevantes y trasladables a la clínica. Asimismo, el desarrollo de sistemas biomiméticos in vitro del microentorno tumoral de uso generalizado es posible mediante el desarrollo de dispositivos de fácil uso, así como del establecimiento de métodos robustos de caracterización de los mismos, tanto in situ como “aguas abajo” del establecimiento de los modelos.
Bibliografía:
1. Balkwill FR, Capasso M, Hagemann T (2012) The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci 125: 5591-5596.
2. Junttila MR, de Sauvage FJ (2013) Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature 501: 346-354.
3. Scannell JW, Blanckley A, Boldon H, Warrington B (2012) Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D; efficiency. Nat Rev Drug Discov 11: 191-200.
4. Adriani G, Pavesi A, Tan AT, Bertoletti A, Thiery JP, et al. (2016) Microfluidic models for adoptive cell-mediated cancer immunotherapies. Drug Discov Today 21: 1472-1478.
5. Ayuso JM, Virumbrales-Munoz M, Lacueva A, Lanuza PM, Checa-Chavarria E, et al. (2016) Development and characterization of a microfluidic model of the tumour microenvironment. Sci Rep 6: 36086.
6. Ayuso JM, Monge R, Martínez-González A, Virumbrales-Muñoz M, Llamazares GA, et al. (2017) Glioblastoma on a microfluidic chip: Generating pseudopalisades and enhancing aggressiveness through blood vessel obstruction events. Neuro-Oncology: now230.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: cultivo celular ; tecnología de materiales
Knowledge area: Bioquímica y biología molecular
Department: Instituto de Investigación en Ingeniería de Aragón (I3A)
Nota: Presentado: 09 06 2017
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Instituto de Investigación en Ingeniería de Aragón (I3A), 2017
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Record created 2017-06-16, last modified 2019-02-19
