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000065466 005__ 20180219131715.0
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000065466 1001_ $$aGil Clavero, Sergio
000065466 24200 $$aSite-directed mutagenesis and enzymatic assay of R501P mutation in HMGCS2 gene
000065466 24500 $$aMutagénesis dirigida y ensayo enzimático de la mutación R501P en el gen HMGCS2
000065466 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza$$c2017
000065466 506__ $$aby-nc-sa$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/
000065466 520__ $$aIntroducción: la deficiencia de HMG-CoA sintasa mitocondrial humana es un error congénito del metabolismo que muestra un patrón de herencia autosómico recesivo. Tiene muy baja prevalencia. Está producida por mutaciones en homocigosis o heterocigosis compuesta del gen HMGCS2. Fue descrita por primera vez en 1997. La enzima mHS tiene un rol importante en la cetogénesis, ya que es la encargada de catalizar la condensación del acetil-CoA y el acetoacetil-CoA para formar HMG-CoA en las mitocondrias de los hepatocitos. Su clínica es muy inespecífica y se caracteriza por crisis agudas de hipoglucemia con hipocetonemia. Los síntomas más frecuentes son náuseas, vómitos, irritabilidad y letargia. Sin tratamiento, puede progresar a encefalopatía, coma y muerte. Material y métodos: en este trabajo se ha utilizado un método de mutagénesis dirigida y ensayo enzimático “in vitro” para medir la actividad de la variante alélica R501P, reportada por primera vez. Para llevarlo a cabo, se han empleado células de Escherichia coli usando el vector de expresión pMAL-c2X-mHS. Posteriormente, el efecto de cada mutación en la estructura de la proteína ha sido analizado con un modelo bioinformático en 3D. Además, se ha comparado su actividad con la de la proteína wild-type (WT) y con la variante R501Q, previamente reportada y de localización análoga en la proteína. Resultados: todas las proteínas recombinantes se han conseguido obtener solubles en disolución. La proteína WT ha alcanzado una concentración de 0,298μg/μl y una actividad enzimática de 0,910 U/mg, mientras que las variantes R501P y R501Q han presentado una concentración de 0,241μg/μl y 0,304μg/μl respectivamente y una ausencia total de actividad. Las predicciones bioinformáticas se correlacionan con estos resultados: el efecto producido en ambas mutaciones es la distorsión de una zona de la proteína próxima a la superficie de dimerización, impidiendo así su actividad catalítica. Discusión: por tercera vez se ha comprobado la buena reproductibilidad del método de expresión, purificación y ensayo enzimático de la enzima mHS humana. Debido a la inespecificidad del diagnóstico clínico y bioquímico, el estudio molecular y la caracterización funcional de las mutaciones “in vitro” emerge como el método de elección para el diagnóstico de certeza de estos pacientes.
000065466 521__ $$aGraduado en Medicina
000065466 540__ $$aDerechos regulados por licencia Creative Commons
000065466 700__ $$aPié Juste, Juan$$edir.
000065466 7102_ $$aUniversidad de Zaragoza$$bFarmacología y Fisiología$$cFisiología
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