Alcalá García, Leticia
Simón Valencia, Mª del Carmen (dir.) ; Torres Manrique, Carmen (dir.) ; Rezusta López, Antonio (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2018
Abstract: La resistencia a los antibióticos (RA) es un problema muy importante en Medicina humana y en Veterinaria, y puede afectar tanto a las bacterias patógenas como a las bacterias comensales presentes en diversos nichos ecológicos, que pueden actuar como vehículos en la transferencia de dicha resistencia entre las mismas. En la actualidad, existe un conocimiento mayor acerca de la RA en microorganismos del ámbito humano o de animales de producción o de compañía, pero los datos acerca de la contribución de los animales salvajes a la problemática de la RA son escasos. Escherichia coli, Staphylococcus y Enterococcus son microorganismos comensales en el hombre y muchos animales, pero de la misma manera pueden actuar como patógenos oportunistas. El objetivo del trabajo fue conocer la frecuencia y/o diversidad de especies de E. coli, Enterococcus spp. y Staphylococcus spp. en animales salvajes de la Comunidad Autónoma (C.A.) de Aragón, determinar sus fenotipos de RA y analizar determinados genotipos de resistencia de interés y, además, valorar sus posibles relaciones epidemiológicas con los ambientes humanos y veterinarios.
El estudio abarcó el periodo 2012-2015. Las muestras fueron facilitadas por el Centro de Recuperación de Fauna Salvaje de La Alfranca (CRFSA) (Pastriz, Zaragoza) y por profesionales veterinarios relacionados con actividades de caza, en la Provincia de Zaragoza y Teruel. Dichas muestras se tomaron de las fosas nasales y la cloaca (aves) o recto (mamíferos), en el momento de la llegada del animal al CRFSA o inmediatamente tras la caza en las especies cinegéticas, y se remitieron al laboratorio de Enfermedades Infecciosas y Epidemiología de la Facultad de Veterinaria (Zaragoza, España). Allí se procedió al aislamiento de los microorganismos: E. coli (Agar McConkey y McConkey con cefotaxima (1µg/ml)), Enterococcus spp. (Agar Slanetz-Barley y Slanetz-Barley con vancomicina (4µg/ml)) y Staphylococcus spp. (Agar manitol salino y medio comercial ORSAB, para la detección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SARM)). La confirmación de su identificación fue llevada a cabo en el Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza, España) mediante proteómica (MALDI-TOF MS Bruker® (Biotyper 3)) en el equipo disponible en el Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza, España). El estudio se completó con la determinación de los patrones fenotípicos de resistencia mediante el test de Kirby Bauer (KB) a un amplio grupo de antibióticos de diferentes familias, siguiendo los criterios del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, actualización del 2015). De la misma manera, se realizó la detección fenotípica de producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) mediante el test del triple disco (amoxicilina-clavulánico, cefotaxima y ceftazidima). Posteriormente, los aislados con fenotipos de resistencia de interés fueron remitidos al Área de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de La Rioja (Logroño, España) para seguir con su caracterización genotípica mediante técnicas de biología molecular (Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y secuenciación). El análisis epidemiológico se realizó mediante el programa informático Epi info (www.cdc.int). El tipo de variable estudiada, cualitativa o cuantitativa, determinó la prueba estadística utilizada en cada caso. Para las primeras, se utilizaron Chi–cuadrado (χ2) y ANOVA, considerando que existía asociación cuando el valor del estadístico "p" era ≤0,05.
Se tomaron muestras de 220 animales (aves: 117; mamíferos: 103), siendo los más representativos del estudio el Conejo de campo (17,27%), el Jabalí (7,73%), el Buitre leonado (5,91%), la Cigüeña blanca (5%), el Erizo europeo (5%), el Búho real (4,55%) y el Aguilucho lagunero (4,09%). Se aislaron 677 bacterias distintas: a) 158 E. coli (aves: 103; mamíferos: 55); b) 272 Enterococcus spp. (aves: 146; mamíferos: 126), de 9 especies diferentes y con predominio de E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum y E. casseliflavus; y c), 247 Staphylococcus spp. (aves: 136; mamíferos: 111), de 20 especies diferentes y con S. sciuri como principal representante. El 15,38% de los estafilococos aislados fueron del grupo coagulasa-positivo (S. aureus, S. pseudintermedius/intermedius y S. delphini).
Entre los aislados de E. coli de aves, destaca la resistencia a ampicilina, tetraciclina y ciprofloxacina (20-39%), siendo los valores superiores a los detectados en los aislados de mamíferos (7-21%). Los niveles más altos de resistencia se observaron en aislados de Cigüeña blanca y Buitre leonado, especialmente en aquellos animales consumidores de carroña. Se detectó resistencia a cefotaxima en el 16,50% de los aislados de aves y en el 9,09% de los de mamíferos, y la mayor parte de esos aislados eran portadores de BLEEs, identificándose los genes codificantes de SHV-12, CTX-M-1 y CTX-M-14. De la misma manera se ha detectado el gen de la enzima CMY-2 (β-lactamasa plasmídica de tipo AmpC), en dos de los aislados de E. coli resistentes a cefotaxima (ave y mamífero). Por otro lado, se observó un nivel alto de la resistencia a estreptomicina en los aislados de E. coli de mamíferos (34,55%). No se encontró resistencia a imipenem en los aislados de E. coli de aves y mamíferos, ni resistencia a gentamicina, tobramicina o amikacina en los aislados de mamíferos.
Entre los aislados de Enterococcus spp., destaca la elevada resistencia a eritromicina y tetraciclina detectada tanto en aves (48,95% y 56,64%, respectivamente), como en mamíferos (25,6%, 32,8%, respectivamente). Se observó una relación de la resistencia a tetraciclina con la alimentación, lo que sugeriría un origen humano o agrícola. Se evidenció un elevado nivel de resistencia a quinupristina-dalfopristina entre los aislados de E. faecium tanto de aves (65,70%) como de mamíferos (50%). Predominaron también los enterococos resistentes a ciprofloxacina (aves (61,54%) y mamíferos (52%)), destacando su frecuencia en los mustélidos, condicionada por la dieta de estos animales (carne y peces), y señalando al medio acuático como potencial factor de diseminación de dicha resistencia. Se detectaron enterococos resistentes a todos los antibióticos estudiados salvo a la vancomicina (no se detectaron enterococos con resistencia adquirida).
Se ha detectado resistencia a meticilina en 4 aislados de S. aureus de Erizo europeo (con el gen mecA y la línea genética ST1) y de Conejo de campo (con el gen emergente mecC y la línea genética CC130). La resistencia al ácido fusídico (aves (38,97%) y mamíferos (63,96%)), fue muy elevada entre los estafilococos aislados, principalmente en las aves en la familia Columbidae, animales con hábitos urbanos. También fue detectada en los 5 estafilococos aislados de Nutria, animal de hábitos piscívoros. De la misma manera, se detectaron valores de resistencia a penicilina relativamente altos (aves (26,47%) y mamíferos (42,34%)), principalmente en los mamíferos del CRFSA y en los animales carroñeros. No se detectaron estafilococos resistentes a cloranfenicol (aves), sulfametoxazol-trimetoprim (mamíferos) o vancomicina (aves y mamíferos).
Como conclusión, se observa una gran diversidad de especies de Staphylococcus (incluidos coagulasa positivos como S. aureus) y de Enterococcus en los animales estudiados y es relevante la detección de aislados de E. coli productores de BLEEs, o de β-lactamasas AmpC plasmídicas en aves y mamíferos salvajes, así como la detección de SARM portadores de los genes mecA o mecC. Se han evidenciado resistencias a antibióticos de relevancia clínica. La RA detectada en los animales salvajes podría tener relación con la utilización de antibióticos en animales de producción, la contaminación del ambiente, principalmente las superficies dedicadas al cultivo agrícola, con los residuos y estiércol de estos animales y las aguas residuales y basuras de origen humano. Los animales salvajes constituyen un eslabón en la comprensión de la diseminación de la resistencia a los antibióticos en la interfaz animal-seres humanos-medio.
Abstract (other lang.):
El estudio abarcó el periodo 2012-2015. Las muestras fueron facilitadas por el Centro de Recuperación de Fauna Salvaje de La Alfranca (CRFSA) (Pastriz, Zaragoza) y por profesionales veterinarios relacionados con actividades de caza, en la Provincia de Zaragoza y Teruel. Dichas muestras se tomaron de las fosas nasales y la cloaca (aves) o recto (mamíferos), en el momento de la llegada del animal al CRFSA o inmediatamente tras la caza en las especies cinegéticas, y se remitieron al laboratorio de Enfermedades Infecciosas y Epidemiología de la Facultad de Veterinaria (Zaragoza, España). Allí se procedió al aislamiento de los microorganismos: E. coli (Agar McConkey y McConkey con cefotaxima (1µg/ml)), Enterococcus spp. (Agar Slanetz-Barley y Slanetz-Barley con vancomicina (4µg/ml)) y Staphylococcus spp. (Agar manitol salino y medio comercial ORSAB, para la detección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SARM)). La confirmación de su identificación fue llevada a cabo en el Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza, España) mediante proteómica (MALDI-TOF MS Bruker® (Biotyper 3)) en el equipo disponible en el Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza, España). El estudio se completó con la determinación de los patrones fenotípicos de resistencia mediante el test de Kirby Bauer (KB) a un amplio grupo de antibióticos de diferentes familias, siguiendo los criterios del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, actualización del 2015). De la misma manera, se realizó la detección fenotípica de producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) mediante el test del triple disco (amoxicilina-clavulánico, cefotaxima y ceftazidima). Posteriormente, los aislados con fenotipos de resistencia de interés fueron remitidos al Área de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de La Rioja (Logroño, España) para seguir con su caracterización genotípica mediante técnicas de biología molecular (Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y secuenciación). El análisis epidemiológico se realizó mediante el programa informático Epi info (www.cdc.int). El tipo de variable estudiada, cualitativa o cuantitativa, determinó la prueba estadística utilizada en cada caso. Para las primeras, se utilizaron Chi–cuadrado (χ2) y ANOVA, considerando que existía asociación cuando el valor del estadístico "p" era ≤0,05.
Se tomaron muestras de 220 animales (aves: 117; mamíferos: 103), siendo los más representativos del estudio el Conejo de campo (17,27%), el Jabalí (7,73%), el Buitre leonado (5,91%), la Cigüeña blanca (5%), el Erizo europeo (5%), el Búho real (4,55%) y el Aguilucho lagunero (4,09%). Se aislaron 677 bacterias distintas: a) 158 E. coli (aves: 103; mamíferos: 55); b) 272 Enterococcus spp. (aves: 146; mamíferos: 126), de 9 especies diferentes y con predominio de E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum y E. casseliflavus; y c), 247 Staphylococcus spp. (aves: 136; mamíferos: 111), de 20 especies diferentes y con S. sciuri como principal representante. El 15,38% de los estafilococos aislados fueron del grupo coagulasa-positivo (S. aureus, S. pseudintermedius/intermedius y S. delphini).
Entre los aislados de E. coli de aves, destaca la resistencia a ampicilina, tetraciclina y ciprofloxacina (20-39%), siendo los valores superiores a los detectados en los aislados de mamíferos (7-21%). Los niveles más altos de resistencia se observaron en aislados de Cigüeña blanca y Buitre leonado, especialmente en aquellos animales consumidores de carroña. Se detectó resistencia a cefotaxima en el 16,50% de los aislados de aves y en el 9,09% de los de mamíferos, y la mayor parte de esos aislados eran portadores de BLEEs, identificándose los genes codificantes de SHV-12, CTX-M-1 y CTX-M-14. De la misma manera se ha detectado el gen de la enzima CMY-2 (β-lactamasa plasmídica de tipo AmpC), en dos de los aislados de E. coli resistentes a cefotaxima (ave y mamífero). Por otro lado, se observó un nivel alto de la resistencia a estreptomicina en los aislados de E. coli de mamíferos (34,55%). No se encontró resistencia a imipenem en los aislados de E. coli de aves y mamíferos, ni resistencia a gentamicina, tobramicina o amikacina en los aislados de mamíferos.
Entre los aislados de Enterococcus spp., destaca la elevada resistencia a eritromicina y tetraciclina detectada tanto en aves (48,95% y 56,64%, respectivamente), como en mamíferos (25,6%, 32,8%, respectivamente). Se observó una relación de la resistencia a tetraciclina con la alimentación, lo que sugeriría un origen humano o agrícola. Se evidenció un elevado nivel de resistencia a quinupristina-dalfopristina entre los aislados de E. faecium tanto de aves (65,70%) como de mamíferos (50%). Predominaron también los enterococos resistentes a ciprofloxacina (aves (61,54%) y mamíferos (52%)), destacando su frecuencia en los mustélidos, condicionada por la dieta de estos animales (carne y peces), y señalando al medio acuático como potencial factor de diseminación de dicha resistencia. Se detectaron enterococos resistentes a todos los antibióticos estudiados salvo a la vancomicina (no se detectaron enterococos con resistencia adquirida).
Se ha detectado resistencia a meticilina en 4 aislados de S. aureus de Erizo europeo (con el gen mecA y la línea genética ST1) y de Conejo de campo (con el gen emergente mecC y la línea genética CC130). La resistencia al ácido fusídico (aves (38,97%) y mamíferos (63,96%)), fue muy elevada entre los estafilococos aislados, principalmente en las aves en la familia Columbidae, animales con hábitos urbanos. También fue detectada en los 5 estafilococos aislados de Nutria, animal de hábitos piscívoros. De la misma manera, se detectaron valores de resistencia a penicilina relativamente altos (aves (26,47%) y mamíferos (42,34%)), principalmente en los mamíferos del CRFSA y en los animales carroñeros. No se detectaron estafilococos resistentes a cloranfenicol (aves), sulfametoxazol-trimetoprim (mamíferos) o vancomicina (aves y mamíferos).
Como conclusión, se observa una gran diversidad de especies de Staphylococcus (incluidos coagulasa positivos como S. aureus) y de Enterococcus en los animales estudiados y es relevante la detección de aislados de E. coli productores de BLEEs, o de β-lactamasas AmpC plasmídicas en aves y mamíferos salvajes, así como la detección de SARM portadores de los genes mecA o mecC. Se han evidenciado resistencias a antibióticos de relevancia clínica. La RA detectada en los animales salvajes podría tener relación con la utilización de antibióticos en animales de producción, la contaminación del ambiente, principalmente las superficies dedicadas al cultivo agrícola, con los residuos y estiércol de estos animales y las aguas residuales y basuras de origen humano. Los animales salvajes constituyen un eslabón en la comprensión de la diseminación de la resistencia a los antibióticos en la interfaz animal-seres humanos-medio.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: antibióticos
Titulación: Programa de Doctorado en Medicina y Sanidad Animal
Plan(es): Plan 498
Department: Patología Animal
Nota: Presentado: 15 03 2018
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Patología Animal, 2018
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