Farmacogenómica mitocondrial: Código de barras para la terapia con antibióticos

Pacheu Grau, David
Ruiz Pesini, Eduardo (dir.)

Universidad de Zaragoza, 2012

Resumen: Antibióticos y rRNAs: Alrededor del 40% de los antibióticos afectan la síntesis proteica (Bashan et al, 2003). Los ribosomas son ribozimas. Sus funciones más importantes las lleva a cabo el RNA ribosómico (rRNA) y es aquí donde la mayoría de los antibióticos ribosomales interactúan (Schlunzen et al, 2001; Auerbach et al, 2004; Tenson et al, 2006). La comparación de los rRNAs de bacterias y eucariotas ha mostrado diferencias sutiles en los lugares funcionales, a pesar de su conservación (Bottger et al, 2001). Estas diferencias pueden determinar la selectividad de la droga (Auerbach et Al, 2004). Así, un nucleótido único puede determinar la selectividad de drogas que afectan la síntesis de proteínas (Schlunzen et al, 2001; Bottger et al, 2001) pero una multitud de nucleótidos diferentes participan en la unión de una droga a su región diana en el rRNA y, correspondientemente, un numero de sustituciones de nucleótidos diferentes pueden estar asociadas con la selectividad y resistencia adquirida a las drogas (Bottger et al, 2001). Un antibiótico podría unirse a bolsillos ribosomales ligeramente diferentes de modos distintos (Tenson et al, 2006). Los rRNAs eubacterianos (16S y 23S rRNAs) son evolutivamente más cercanos a los mitocondriales (12S y 16S rRNAs) que a los eucariotas citosólicos (18S y 28S rRNAs). La similaridad estructural de los rRNAs mitocondriales y eubacterianos permite que algunos antibióticos inhiban la traducción mitocondrial (Tenson et al, 2006; Bottger et al, 2001), así contribuyendo a la toxicidad de estas drogas. Antibióticos y síntesis de proteínas mitocondrial: Las tetraciclinas y el tiostrepton muestran efectos inhibitorios similares en un sistema de traducción in vitro tanto en Escherichia coli (Ec) como en mitocondrias (mt). El cloranfenicol y las tetraciclinas también inhiben la síntesis de proteínas en mitocondrias intactas (Mckee et al, 2006). Por ello, el sitio de unión de estos antibióticos en el ribosoma bacteriano parece estar conservado en los ribosomas mitocondriales. El cloranfenicol se usaba ampliamente en el pasado. Sin embargo, este antibiótico es hematotóxico y la inhibición de la síntesis proteica mitocondrial parece ser paralela a la mielosupresión inducida por el fármaco (Denslow et al, 1987). Las oxazolidinonas inhiben la síntesis de proteínas bacteriana y mitocondrial (Mckee et al, 2006). Aquellas con las propiedades antibacterianas más potentes son también los inhibidores mitocondriales más potentes, habiendo sido descritas como causantes de mielosupresión después de una administración prolongada (Nagiec et al, 2005) y también acidosis láctica, neuropatías periféricas y ópticas, todos ellos fenotipos frecuentes en patología mitocondrial. El crecimiento de células humanas en cultivo es inhibido por la eritromicina y algunas resistencias a este fármaco son heredadas citoplasmicamente (Doersen et al, 1979). Además, la eritromicina puede haber acelerado una crisis bioenergética en un paciente con la enfermedad de LHON (Luca et al, 2004). Los aminoglicósidos administrados en altas dosis o por un largo periodo de tiempo pueden concentrarse en la coclea y conducir a ototoxicidad. Algunos pacientes desarrollan perdida de audición después de un tratamiento con la dosis convencional, o incluso con una sola dosis o por un corto periodo. Estos casos de ototoxicidad por aminoglicosidos pueden tener una predisposición genética. La hipersensibilidad a los aminoglicosidos es transmitida predominantemente por herencia materna en la sordera ototoxica, así sugiriendo una implicación del genoma mitocondrial (Xing et al, 2007). Además, se han descrito defectos en la síntesis de proteínas y disfunciones en el sistema OXPHOS en las mitocondrias de algunos de estos individuos (Guan et al, 2000; Zhao et al, 2005). Como los efectos tóxicos de los antibióticos son observados en un número limitado de pacientes, parecería que la toxicidad depende de las variaciones genéticas entre individuos. Así, las variaciones genéticas poblaciones en los genes de los rRNA mitocondriales (mt-rRNA) pueden afectar la susceptibilidad o resistencia de los individuos a los antibióticos. Antibióticos y variantes genéticas del mtDNA: La interacción de un antibiótico con un bolsillo ribosomal puede estar influenciada no solo por los sitios más importantes sino también por residuos de rRNA periféricos menos importantes. Mutaciones en estas posiciones pueden disminuir la actividad de los ribosomas mitoncondriales y debido a esto, incluso una inhibición limitada puede llevar los niveles de síntesis de proteínas por debajo del limite umbral (Jacobs et al, 2003). Los aminoglicósidos pueden interferir en la síntesis de proteínas mitocondrial. La consecuencia es daño neuronal y perdida de audición. Se ha observado que las mutaciones 1494U y 1555G en el 12S rRNA, que incrementan la similitud con su homólogo eubacteriano, están relacionadas con la perdida de audición inducida por aminoglicosidos (Fischel-Ghodsian et al, 2004). Si estas variantes del mtDNA fueran deletéreas principalmente en presencia de antibióticos, entonces serían variantes neutras hasta el comienzo de la era de los antibióticos y podrían estar bien representadas en la población (Pacheu-Grau et al, 2010). OBJETIVOS Hay publicadas más de 3,500 secuencias de mtDNA humano y se conocen las secuencias de muchos rRNAs citoplasmáticos de eucariotas, arqueobacterias y eubacterias que presentan resistencia o susceptibilidad a diferentes antibióticos y también se conoce la estructura cristalina de algunos ribosomas. Hoy tenemos modelos de laboratorio convenientes para analizar variantes particulares del mtDNA. Por lo tanto, sería importante establecer una correlación entre los polimorfismos de los mt-rRNAs humanos y la sensibilidad o resistencia de la síntesis proteica mitocondrial a los inhibidores de la traducción bacteriana. Tal enfoque farmacogenómico podría ayudar a optimizar el régimen de antibióticos basándose en el fondo genético del paciente (Tenson et al, 2006). METODOLOGÍA El elemento clave de la metodología en esta investigación es la técnica de los cíbridos transmitocondriales que se basa en la construcción de líneas celulares con mtDNAs diferentes pero con el mismo fondo genético nuclear y que crecen en las mismas condiciones. Así, líneas celulares sin mtDNA se fusionan con plaquetas que tienen mitocondrias y mtDNA pero no núcleo. De esta forma, las diferencias fenotípicas de estas líneas celulares se deberán exclusivamente al mtDNA y en nuestro caso a la interacción especifica entre variantes genéticas particulares de los mt-rRNAs con diferentes antibióticos. Las técnicas utilizadas para analizar estas líneas celulares serán curvas de crecimiento, consumo de oxigeno, actividad respiratoria de los complejos, producción de ROS, niveles de los complejos OXPHOS, síntesis de proteínas mitocondrial, niveles de RNA y mtDNA, secuenciación de DNA etc. También se realizaran estudios epidemiológicos, para estudiar la posible influencia de estas variantes genéticas particulares de los mt-rRNAs en fenotipos relacionados con posibles defectos en el sistema de traducción mitocondrial, o asociados a problemas tras un tratamiento con antibióticos. Estos pueden ser pacientes de la enfermedad de Meniere (tratados con gentamicina intratimpánica), personas con perdida de audición asociada a la edad (presbiacusia)¿etc. En este caso, las técnicas utilizadas serán las utilizadas para determinar el genotipo mitocondrial, o la busqueda de nuevas mutaciones: PCR/RFLP, secuenciación, PCR cuantitativa a tiempo real, etc.

Pal. clave: antibióticos ; mtdna ; mt-rrna ; snp ; toxicogenómica ; mutaciones genéticas

Área de conocimiento: Genética

Departamento: Bioquímica y Biología Molecular y Celular

Nota: Presentado: 16 03 2012

Nota: Tesis-Univ. Zaragoza