Relación de la melatonina con el metabolismo del óxido nítrico en espermatozoides ovinos

Calvo García, Silvia
Pérez Pe, Rosaura (dir.) ; Casao Gascón, Adriana (dir.)

Universidad de Zaragoza, CIEN, 2018
Bioquímica y Biología Molecular y Celular department, Bioquímica y Biología Molecular area

Máster en Biología Molecular y Celular

Abstract: En la especie ovina la reproducción tiene un carácter estacional muy marcado regulado por la secreción de melatonina. Esta molécula tiene, además, una gran capacidad antioxidante y es capaz de reducir, entre otras especies reactivas, los niveles de óxido nítrico (NO). El NO se genera vía oxidación de L-arginina por la actividad de la óxido nítrico sintasa o sintetasa (NOS). Existen tres isoformas de esta enzima: la neuronal (nNOS), la endotelial (eNOS) y la inducible (iNOS). En espermatozoides humanos se han identificado las tres isoformas de NOS y se ha demostrado que su actividad se incrementa a lo largo del proceso de capacitación in vitro. En espermatozoides ovinos, cuya capacitación in vitro resulta mucho más complicada que en otras especies, no existen estudios que hayan identificado alguna de las isoformas de NOS. Por tanto, el objetivo de este Trabajo de Fin de Master es estudiar la acción de la melatonina a diferentes concentraciones fisiológicas, sobre los niveles de NO en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes, identificar si las tres isoformas descritas de NOS están presentes en espermatozoides ovinos y evaluar el efecto de la melatonina sobre estas isoformas de NOS. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 °C y 5% de C02) en medio TALP (control), con alto cAMP (cocktail) y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 µM) añadidas al medio cocktail, y se evaluaron los niveles de NO mediante citometría de flujo. Para determinar si este efecto estaba mediado por la acción de la óxido nítrico sintasa, previamente se identificaron en espermatozoides ovinos las tres isoformas de la enzima descritas para otras especies, tras poner a punto los protocolos de western blot y de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Finalmente se evaluaron los cambios en la distribución de estas isoformas de NOS mediante IFI tras incubación de los espermatozoides en presencia de melatonina. Los resultados obtenidos indican que la melatonina, a concentración 1 µM, es capaz de reducir significativamente los niveles de NO, los cuales se ven incrementados durante la capacitación espermática. Además se han identificado, por primera vez en el espermatozoide ovino, las tres isoformas de NOS, mediante western blot e inmunofluorescencia indirecta. La IFI también reveló tres inmunotipos espermáticos para cada una de las isoformas de NOS, cuyos porcentajes se modificaron durante la capacitación y el tratamiento con melatonina. Así, la localización en el borde apical de las isoformas eNOS e iNOS disminuye con la capacitación y la melatonina, a concentración 1 µM y 100 pM, modifica el efecto producido por los agentes capacitantes sobre el porcentaje de los inmunotipos de la nNOS e iNOS, revirtiéndolo en la primera y aumentándolo en la segunda. Por tanto, la melatonina durante la capacitación de los espermatozoides ovinos parece ejercer un papel antioxidante reduciendo los niveles de NO, posiblemente generado por las isoformas identificadas de la NOS. Además, el tratamiento con melatonina parece modificar la localización de alguna de las isoformas de la NOS en el espermatozoide ovino.

Tipo de Trabajo Académico: Trabajo Fin de Master