Evaluación de diferentes métodos para la detección de esporos de clostridios butiricos en leche de vaca

Navarro García, Juan Pedro
Sánchez Paniagua, Mª Lourdes (dir.) ; Esteban Pellejero, Miriam (dir.)

Universidad de Zaragoza, VET, 2019
Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos, Área de Tecnología de Alimentos

Máster Universitario en Calidad, Seguridad y Tecnología de los Alimentos

Resumen: El defecto de la hinchazón tardía del queso es causado por la germinación de esporos del género Clostridium, generalmente C. tyrobutyricum, durante la etapa de maduración. Este defecto es uno de los mayores problemas en la fabricación de quesos de pasta dura y semi-dura, provocando alteraciones en la textura y sabor del queso, así como importantes pérdidas económicas. En la actualidad, no existe un método rápido que sea capaz de detectar leche contaminada con esporos butíricos. Los métodos empleados para la detección de los clostridios butíricos son principalmente microbiológicos, los cuales necesitan largos tiempos de incubación y presentan una baja sensibilidad. Por lo tanto, en este estudio se pretendió poner las bases para el desarrollo de un método rápido y fiable, para detectar esporos butíricos en leche, basado en PCR a tiempo real (qPCR) y compararlo con el cultivo microbiológico. Por un lado, para la cuantificación de esporos en leche, se ha necesitado un pretratamiento de la leche con subtilisina, la ruptura mediante microondas de los esporos y una etapa de purificación del DNA. Para demostrar la aplicabilidad del método, se analizaron muestras de leche de vaca sospechosas de estar contaminadas con clostridios butíricos. Por otro lado, también se trató de evaluar la posible aplicación de micropartículas magnéticas (MMPs) funcionalizadas con un ligando específico, afín por los esporos, para su bioseparación de la leche. Los resultados indicaron que algunas muestras de leche estaban contaminadas con esporos de C. tyrobutyricum; sin embargo, se detectaron diferencias en algunas muestras, entre los resultados de la amplificación del DNA y los del cultivo microbiológico. Finalmente, mediante la utilización de MMPs para la separación de esporos butíricos, se obtuvo mayor afinidad por los esporos de C. tyrobutyricum, que por los de C. butyricum y C. beijerinckii.
The late bowing defect in cheese is caused by the germination of spores from the genus Clostridium, usually C. tyrobutyricum, during the ripening stage. This defect is one of the major problems in the manufacture of hard and semi-hard cheeses, causing alterations in their texture and flavour, as well as, significant economic losses. Nowadays, there are not fast methods capable of detecting milk contaminated with butyric spores. The methods used for the detection of butyric clostridia are mainly microbiological which need longer incubation times and have low sensitivity. Thus, this study pursued to provide the basis for the development of a rapid and reliable method for detecting butyric spores in milk based on real-time PCR (qPCR), comparing it with microbiological culture. On one hand, for spore quantification in milk, a pre-treatment of the milk with subtilisin is needed, followed by a microwave disruption of spores and a final purification stage of the DNA. To demonstrate the applicability of the method, samples of cow's milk suspected of being contaminated were analyzed. On the other hand, the possible application of magnetic microparticles (MMPs) functionalized with a specific ligand for the spores, was also evaluated for their bioseparation from milk. The results indicated that some samples of milk were found to be contaminated with C tyrobutyricum spores; however, differences were detected in some samples between the results of DNA amplification and those of microbiological culture. Finally, higher affinity was obtained by using MMPs to separate butyric spores for C. tyrobutyricum than for C. butyricum and C. beijerinckii.

Tipo de Trabajo Académico: Trabajo Fin de Master