000089870 001__ 89870 000089870 005__ 20210520140801.0 000089870 037__ $$aTESIS-2020-092 000089870 041__ $$aspa 000089870 080__ $$a543 000089870 1001_ $$aLapieza Remón, Mª Pilar 000089870 24500 $$aAportación de la cromatografía en capa fina de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas y de la fluorescencia de flavoenzimas a la lipidómica y a otros problemas del análisis de lípidos 000089870 260__ $$aZaragoza$$bUniversidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad$$c2018 000089870 300__ $$a302 000089870 4900_ $$aTesis de la Universidad de Zaragoza$$v2020-92$$x2254-7606 000089870 500__ $$aPresentado: 30 05 2018 000089870 502__ $$aTesis-Univ. Zaragoza, Química Analítica, 2018$$bZaragoza, Universidad de Zaragoza$$c2018 000089870 506__ $$aby-nc-nd$$bCreative Commons$$c3.0$$uhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es 000089870 520__ $$aLa Lipidómica hace referencia a la disciplina de investigación basada en el análisis de las especies lipídicas, e incluye la identificación y cuantificación de los miles de especies moleculares de lípidos celulares en sistemas biológicos. <br />Los avances en tecnología analítica, especialmente en Espectrometría de Masas (MS) han impulsado la investigación en Lipidómica y la del análisis de lípidos en matrices de interés industrial relacionadas con la alimentación y la bioenergía. <br />Aunque la plataforma más utilizada es sin duda el acoplamiento con la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Columna, con ionización de tipo electrospray, LC-MS (ESI), no hay un único esquema basado en MS que pueda cubrir la detección del lipidoma completo, debido a la diversidad de las estructuras moleculares existentes. <br />En esta Tesis se ha evaluado la aportación de dos técnicas y se han desarrollado nuevas metodologías analíticas para el análisis de diferentes clases de lípidos en muestras complejas que proceden de matrices diferentes utilizando dos enfoques distintos.<br />Por un lado, para el análisis de las especies moleculares individuales de diferentes clases de esfingolípidos (SL) en plasma humano, lípidos neutros (LN) y ácidos grasos (FA) en biodiésel, y fosfolípidos (PL) en extractos de membranas bacterianas y su complejo purificado, se ha llevado a cabo el desarrollo de la técnica de Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia acoplada a técnicas tándem MS (HPTLC-MSn) y de alta resolución HRMS. <br />Desde una misma placa cromatográfica se obtiene:<br />• una separación en clases de lípidos<br />• perfiles semicuantitativos dentro de cada clase de lípidos por ESI-MS <br />• determinación estructural inequívoca y directa de los lípidos individuales y sus especies moleculares por tamden MS/HRMS<br />Se demuestra que esta técnica tiene especial interés en la caracterización rápida de bandas diana en la zona deseada de la placa. La selectividad espacial proporcionada por la técnica la hace complementaria a LC-MS. Otras ventajas son alta capacidad de tratamiento de un elevado número de muestras simultáneamente, desarrollo paralelo de muestras y patrones y bajo coste relativo en tiempo y disolvente. <br />Tradicionalmente el enfoque MS/MS no se había desarrollado en HPTLC debido a que la formación conjunta de especies sodiadas y protonadas complicaba la interpretación de los espectros. Los aductos de sodio de los espectros ESI-MS pueden ser fragmentados en modo ESI+ usando tecnologías de trampa de iones y cuadrupolo TOF. El sodio permanece como carga de los iones producto siendo este hecho útil para la identificación de las estructuras de los lípidos. Los espectros se obtienen de manera rápida, fiable y sencilla a partir de las bandas separadas en la placa mostrando buena intensidad y calidad.<br />Por otro lado, buscando selectividad hacia un único analito se ha desarrollado una metodología analítica basada en la fluorescencia de las flavoenzimas, que permite la determinación de fosfolípidos que contienen colina, como la fosfatidilcolina (PC). <br />Si sobre ella actúa la lipasa (PLC) se obtiene fosforilcolina (ChoP) que a su vez reacciona con la enzima fosfatasa alcalina (AP) obteniendo colina (Ch). <br /> PLC AP ChOx<br />PC-------->ChoP--------->Ch--------->betaina+H2O2<br />La enzima colina oxidasa (ChOx) es una flavoenzima que cambia sus propiedades ópticas durante su reacción con Ch, hecho que se puede utilizar para la determinación de PC o sus metabolitos sin la necesidad de añadir más reactivos que los involucrados en la reacción. <br />En esta tesis esta metodología se aplica a la determinación de ChoP y Ch en muestras de leche infantil poniendo de manifiesto las posibilidades de la técnica:<br />• dependiendo del interés se puede hacer la determinación secuencial o simultánea simplemente cambiando el orden de adición de los reactivos<br />• puesto que la selectividad la aportan las reacciones enzimáticas el tratamiento de muestra es corto y sencillo.<br />• la metodología se ha desarrollado en un lector de placas de pocillos por lo que es muy económico<br />• las interferencias espectrales se evitan de forma sencilla modificando químicamente la enzima para trabajar a longitudes de onda adecuadas.<br />• puesto que las enzimas se regeneran se pueden desarrollar sensores, para lo que se deben inmovilizar en los soportes adecuados. Se eligió un soporte basado en gel de acrilamida pudiéndose desarrollar un sensor tanto para colina como para fosfato de colina.<br /> 000089870 520__ $$a<br /> 000089870 521__ $$97075$$aPrograma de Doctorado en Ciencia Analítica en Química 000089870 6531_ $$aquimica analitica 000089870 6531_ $$alipidos 000089870 700__ $$aCebolla Burillo, Vicente Luis$$edir. 000089870 700__ $$aSanz Vicente, Isabel$$edir. 000089870 7102_ $$aUniversidad de Zaragoza$$bQuímica Analítica 000089870 830__ $$9487 000089870 8560_ $$ftdr@unizar.es 000089870 8564_ $$s16936478$$uhttps://zaguan.unizar.es/record/89870/files/TESIS-2020-092.pdf$$zTexto completo (spa) 000089870 909CO $$ooai:zaguan.unizar.es:89870$$pdriver 000089870 909co $$ptesis 000089870 9102_ $$a$$bQuímica Analítica 000089870 980__ $$aTESIS