Comas Calmet, Laura
Pardo Jimeno, Julián (dir.) ; Gálvez Buerba, Eva (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2020
Abstract: La inflamación es un mecanismo clave en la regulación del sistema inmune, que permite la destrucción de agentes patógenos o la eliminación de células tumorales en condiciones fisiológicas. Sin embargo, cuando la respuesta inflamatoria no se regula de forma adecuada es la principal causa de enfermedades tipo inflamatorio y/o autoinmune de difícil tratamiento. Algunos miembros de la familia de las proteasas de serina, granzimas (gzms), como la gzmA o la gzmK, que ejercen funciones proinflamatorias regulando la producción de citocinas como IL-1β, IL-6 o TNF-α, modulan el balance entre inmunidad protectora o patológica. Recientemente en nuestro grupo de investigación se caracterizó que la gzmA juega un papel fundamental in vivo en algunos procesos inflamatorios como la sepsis bacteriana, la artritis o el cáncer colorrectal. Conjuntamente, se han detectado niveles elevados de la gzmA, gzmB y/o gzmK solubles en fluidos de pacientes con diversas patologías inflamatorias/autoinmunes. Sin embargo, se desconoce la relevancia fisiopatológica de estas gzms extracelulares y, aún más importante, si son funcionalmente activas en dichos fluidos y por lo tanto capaces de contribuir a la progresión de la enfermedad, pudiendo tratarse así tanto de posibles biomarcadores de pronóstico como de dianas terapéuticas.
Durante los últimos años, la nanotecnología se ha convertido en una de las principales promesas en el campo del desarrollo de nuevos fármacos más selectivos y con menos efectos secundarios, ya que multitud de nanomateriales han mostrado ser soportes óptimos para la conjugación o vehiculización de moléculas a utilizar en aplicaciones biomédicas. En particular, las nanopartículas de oro (AuNPs) presentan ventajas adicionales con respecto a otros tipos de nanomateriales, exhibiendo excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño nanométrico, además de ser fácilmente sintetizadas y funcionalizadas con un amplio abanico de ligandos. Sin embargo, y aunque el oro se define como un metal seguro y estable, se ha demostrado que las propiedades fisicoquímicas de las AuNPs influyen directamente sobre su toxicidad. Por ello, la nanotoxicología, un área multidisciplinar recientemente emergida, plantea la realización, junto con los estudios más convencionales de citotoxicidad, como la generación de ROS, de un análisis más amplio y detallado de cada uno de los diferentes tipos de NPs, entre los que se incluyen los estudios de inmunogenicidad, ya que se ha demostrado que las NPs son capaces de interaccionar con los sistemas biológicos pudiendo llegar a causar multitud de efectos adversos.
En este contexto, se planteó que la detección de la gzmA extracelular podría utilizarse como marcador de diagnóstico en sepsis, mientras que su inhibición selectiva haciendo uso de nanomateriales podría servir como posible diana terapéutica para reducir la inflamación asociada a ciertas patologías como el cáncer colorrectal, evitando los posibles efectos adversos generados por los tratamientos convencionales. Asimismo, el estudio más exhaustivo de la influencia de estos nanomateriales sobre la respuesta inmune podría ser clave para confirmar su seguridad e impulsar su uso responsable y sostenible.
Mediante la realización de este trabajo, por un lado, se ha conseguido el desarrollo de un biosensor específico de la gzmA, tanto de origen murino como humano, basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, con una alta sensibilidad así como estabilidad. Mediante el uso de este biosensor, además se ha apoyado la implicación de la gzmA extracelular en la patogénesis de la sepsis y se ha correlacionado la actividad enzimática de dicha proteasa, con el estado de los pacientes con septicemia. Por otro lado, se ha comprobado como las nanocápsulas de quitosano, ampliamente empleadas para la encapsulación de siARN en terapia génica, son internalizadas en el interior de linfocitos T y células NK en un intervalo de tiempo relativamente corto y sin mostrar toxicidad sobre las mismas, representando así un posible sistema de vehiculización adecuado para el silenciamiento de la gzmA. Junto con los estudios de internalización, se han realizado estudios de biodistribución de estos sistemas, ya sea a escala nano o micro, demostrando que las nanocápsulas y microcápsulas de quitosano permiten actuar de forma localizada aumentando el tiempo de retención en la zona del intestino, gracias a las propiedades mucoadhesivas, además de ser completamente eliminadas del organismo sin llegar a producirse su integración en la vía sistémica, lo cual disminuye el riesgo de toxicidad. Por último, también se ha analizado el posible efecto inmunomodulador de las AuNPs, con un tamaño de 14 nm recubiertas con PEG-N3 y PEG-COOH con el 100% de la superficie saturada, y se ha evidenciado que son capaces de modular la producción de citocinas inflamatorias in vitro en macrófagos con fenotipo proinflamatorio o M1 y antiinflamatorio o M2 inducida por lipopolisacárido, así como inhibir la maduración de las células dendríticas analizada por la expresión de las moléculas de superficie CD40, CD80, CD86 y MHCII. Gracias a los ensayos in vivo, se ha manifestado que la presencia de las AuNPs en el microambiente tumoral del melanoma murino B16, provoca un incremento en la expresión de determinados mediadores pro- y antiinflamatorios, así como una alteración de las distintas poblaciones celulares que lo conforman, además de provocar una polarización de los macrófagos asociados a tumor hacia un fenotipo M2 y un aumento de la expresión del factor antitumoral TNF-α, mejorando así la sensibilidad del melanoma al tratamiento con anti-PD-1.
Abstract (other lang.):
Durante los últimos años, la nanotecnología se ha convertido en una de las principales promesas en el campo del desarrollo de nuevos fármacos más selectivos y con menos efectos secundarios, ya que multitud de nanomateriales han mostrado ser soportes óptimos para la conjugación o vehiculización de moléculas a utilizar en aplicaciones biomédicas. En particular, las nanopartículas de oro (AuNPs) presentan ventajas adicionales con respecto a otros tipos de nanomateriales, exhibiendo excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño nanométrico, además de ser fácilmente sintetizadas y funcionalizadas con un amplio abanico de ligandos. Sin embargo, y aunque el oro se define como un metal seguro y estable, se ha demostrado que las propiedades fisicoquímicas de las AuNPs influyen directamente sobre su toxicidad. Por ello, la nanotoxicología, un área multidisciplinar recientemente emergida, plantea la realización, junto con los estudios más convencionales de citotoxicidad, como la generación de ROS, de un análisis más amplio y detallado de cada uno de los diferentes tipos de NPs, entre los que se incluyen los estudios de inmunogenicidad, ya que se ha demostrado que las NPs son capaces de interaccionar con los sistemas biológicos pudiendo llegar a causar multitud de efectos adversos.
En este contexto, se planteó que la detección de la gzmA extracelular podría utilizarse como marcador de diagnóstico en sepsis, mientras que su inhibición selectiva haciendo uso de nanomateriales podría servir como posible diana terapéutica para reducir la inflamación asociada a ciertas patologías como el cáncer colorrectal, evitando los posibles efectos adversos generados por los tratamientos convencionales. Asimismo, el estudio más exhaustivo de la influencia de estos nanomateriales sobre la respuesta inmune podría ser clave para confirmar su seguridad e impulsar su uso responsable y sostenible.
Mediante la realización de este trabajo, por un lado, se ha conseguido el desarrollo de un biosensor específico de la gzmA, tanto de origen murino como humano, basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, con una alta sensibilidad así como estabilidad. Mediante el uso de este biosensor, además se ha apoyado la implicación de la gzmA extracelular en la patogénesis de la sepsis y se ha correlacionado la actividad enzimática de dicha proteasa, con el estado de los pacientes con septicemia. Por otro lado, se ha comprobado como las nanocápsulas de quitosano, ampliamente empleadas para la encapsulación de siARN en terapia génica, son internalizadas en el interior de linfocitos T y células NK en un intervalo de tiempo relativamente corto y sin mostrar toxicidad sobre las mismas, representando así un posible sistema de vehiculización adecuado para el silenciamiento de la gzmA. Junto con los estudios de internalización, se han realizado estudios de biodistribución de estos sistemas, ya sea a escala nano o micro, demostrando que las nanocápsulas y microcápsulas de quitosano permiten actuar de forma localizada aumentando el tiempo de retención en la zona del intestino, gracias a las propiedades mucoadhesivas, además de ser completamente eliminadas del organismo sin llegar a producirse su integración en la vía sistémica, lo cual disminuye el riesgo de toxicidad. Por último, también se ha analizado el posible efecto inmunomodulador de las AuNPs, con un tamaño de 14 nm recubiertas con PEG-N3 y PEG-COOH con el 100% de la superficie saturada, y se ha evidenciado que son capaces de modular la producción de citocinas inflamatorias in vitro en macrófagos con fenotipo proinflamatorio o M1 y antiinflamatorio o M2 inducida por lipopolisacárido, así como inhibir la maduración de las células dendríticas analizada por la expresión de las moléculas de superficie CD40, CD80, CD86 y MHCII. Gracias a los ensayos in vivo, se ha manifestado que la presencia de las AuNPs en el microambiente tumoral del melanoma murino B16, provoca un incremento en la expresión de determinados mediadores pro- y antiinflamatorios, así como una alteración de las distintas poblaciones celulares que lo conforman, además de provocar una polarización de los macrófagos asociados a tumor hacia un fenotipo M2 y un aumento de la expresión del factor antitumoral TNF-α, mejorando así la sensibilidad del melanoma al tratamiento con anti-PD-1.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: bioquimica ; biologia celular ; biologia molecular ; inmunologia
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Nota: Presentado: 06 11 2020
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2020
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