Navarro Domínguez, Jesús María
Galbán Bernal, Javier (dir.) ; De Marcos Ruiz, Susana (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2022
Abstract: En la presente tesis se han desarrollado diversos métodos ópticos enzimáticos para la determinación de aminas biógenas (ABs), que puede ser aplicados en disolución o implementados en biosensores. Como se verá, hay una cierta superposición en cuanto a sus fundamentos y aplicaciones, sin embargo, cada uno de ellos tiene un origen y un propósito distinto. Estas primeras páginas de la Tesis tienen como propósito dar una breve explicación de cómo se han ido gestando estos métodos y, además, presentar un esquema general que ayude a diferenciarlos.
Inicialmente, la Tesis estaba encuadrada dentro de la principal línea que se estaba desarrollando en el grupo de investigación, consistente en la puesta a punto de biosensores enzimáticos ópticos autoindicadores (denominados también “reagentless” o “label-free”). Estos dispositivos aprovechan los cambios que se producen en las propiedades ópticas de las enzimas (absorción o fluorescencia) para llevar a cabo la determinación de los sustratos que participan en las reacciones catalizadas por ellas, sin necesidad de acoplar reacciones indicadoras adicionales. No todas las enzimas tienen propiedades ópticas utilizables. Hasta el inicio de la Tesis se habían desarrollado biosensores basados principalmente en reacciones catalizadas por flavo-enzimas, el cofactor es un grupo flavina, y peroxidasa, el cofactor es un grupo hemo (ver Apéndice 1). La revisión bibliográfica mostró que las reacciones enzimáticas más importantes (y accesibles comercialmente) para AB se basan en enzimas Amino-oxidasas (AO) que catalizan su oxidación según el esquema (1).
AB + O2 -->AO--> Aldehído + NH3 + H2O2 (1)
Las AO más importantes son Diamino Oxidasa (DAO), que cataliza muy eficazmente la oxidación de diaminas (como la putrescina y cadaverina), y la Tiramina Oxidasa (TAO), que hace lo propio con la tiramina (e histamina). Estas enzimas son cobre-dependientes, es decir, contienen coenzimas constituidos por diferentes compuestos de cobre. El objetivo era ver si durante las reacciones enzimáticas se producían cambios en las propiedades de absorción/fluorescencia de estos compuestos de cobre y en estudiar su posible aprovechamiento en el desarrollo de biosensores para AB. Se disponía de resultados preliminares, realizados en esta Tesis, en los que se había desarrollado un biosensor para la determinación de dopamina (una AB neurotransmisora) usando la enzima Lacasa, que es también cobre-dependiente (ver Apéndice 2), por lo que lo que la hipótesis de partida parecía razonable.
Sin embargo, tal como se expone en el capítulo 3 los resultados que se obtuvieron con DAO (y TAO) en disolución acuosa no ofrecieron una sensibilidad lo suficientemente alta como para justificar estudios dirigidos a su implementación en biosensores y su aplicación en muestras reales. Para paliar esta falta de sensibilidad se acopló la Peroxidasa (HRP) sobre la reacción (1). Los resultados obtenidos con esta enzima permitieron mejorar la sensibilidad, pero surgieron problemas relacionados con el mecanismo y las interferencias (se describen también en el capítulo 3) que impidieron su aplicación sobre muestras reales.
Descartado el uso de las propiedades intrínsecas de las enzimas, se optó por buscar metodologías alternativas basadas en el uso de reacciones indicadoras acopladas a la reacción (1). Se abrieron dos alternativas que se fueron desarrollando prácticamente en paralelo y que conforman las dos secciones principales de esta Tesis Doctoral.
La primera de ellas, que se describe en la sección A, consistió en acoplar una reacción indicadora para determinar el H2O2 formado, basada en el uso de la peroxidasa (HRP) y un colorante, según:
H2O2 + Colorante -->HRP --> Colorante oxidado + H2O (2)
El objetivo era también que la metodología se pudiera implementar en un biosensor monouso (tiras reactivas) y usarlo como método de criba visual (o de imagen) para las ABs. Se trata de un método enzimático clásico, donde los colorantes habituales son ABTS y TMB. En realidad, se pensaba que ya existirían metodos para ABs basados en este tipo de reacciones, pero apenas se encontró información bibliográfica. Además, durante el desarrollo del método para Put y Cad con DAO y HRP/ABTS, se obtuvieron una serie de resultados que permitieron aportar nueva información sobre los mecanismos de reacción y aparición del color, procesos interferenciales y metodologías alternativas de trabajo (capítulo 6). Además, por el color formado (azul-verdoso), su uso en tiras reactivas de celulosa resultó no ser el más conveniente, por lo que se sustituyó para este objetivo por TMB, el cuál fue estudiado en paralelo en el grupo de investigación y aplicado directamente a tiras reactivas en esta tesis (capítulo 7).
La segunda alternativa, que corresponde a la sección B, constituye el núcleo más novedoso de esta Tesis. Consistió en sustituir la reacción indicadora (2), por Au(III) como único reactivo auxiliar con el objeto de que se formaran nanopartículas como consecuencia de la reacción enzimática. Esto suponía un reto metodológico, ya que su utilización como regenerador del ciclo catalítico de enzimas y su consecuente formación de nanopartículas in situ no había sido descrito previamente. El objetivo era, no solo diseñar una nueva alternativa indicadora general, sino también simplificar la reacción indicadora, eliminar el HRP y el colorante (evitando así posibles todas las dificultades derivadas de su uso) y evaluar otras posibles ventajas adicionales de su utilización. En el capítulo 9 se describe el mecanismo del uso del Au(III) en la reacción de la Tiramina oxidasa (TAO) y su utilización como método colorimétrico para tiramina. En el capítulo 10 se extrapoló esta metodología en la reacción de la DAO, para así verificar y establecer su uso como una posible nueva vía para la determinación enzimática de diferentes analitos.
Por último, y no menos importante, a raíz del uso del Au(III) en la reacción de la TAO, se observaron señales de fluorescencia en los blancos de reacción, las cuales se asociaron inicialmente a la formación de nanoestructuras de oro previas a la formación de nanopartículas de oro. Este hecho suscitó mucho interés en el desarrollo de esta tesis, por lo que se siguió investigando en esta línea, y tal como se describe en el capítulo 11, se han obtenido unos nanoclusters que permiten la determinación de tiramina sin necesidad de la utilización de TAO.
Abstract (other lang.):
Inicialmente, la Tesis estaba encuadrada dentro de la principal línea que se estaba desarrollando en el grupo de investigación, consistente en la puesta a punto de biosensores enzimáticos ópticos autoindicadores (denominados también “reagentless” o “label-free”). Estos dispositivos aprovechan los cambios que se producen en las propiedades ópticas de las enzimas (absorción o fluorescencia) para llevar a cabo la determinación de los sustratos que participan en las reacciones catalizadas por ellas, sin necesidad de acoplar reacciones indicadoras adicionales. No todas las enzimas tienen propiedades ópticas utilizables. Hasta el inicio de la Tesis se habían desarrollado biosensores basados principalmente en reacciones catalizadas por flavo-enzimas, el cofactor es un grupo flavina, y peroxidasa, el cofactor es un grupo hemo (ver Apéndice 1). La revisión bibliográfica mostró que las reacciones enzimáticas más importantes (y accesibles comercialmente) para AB se basan en enzimas Amino-oxidasas (AO) que catalizan su oxidación según el esquema (1).
AB + O2 -->AO--> Aldehído + NH3 + H2O2 (1)
Las AO más importantes son Diamino Oxidasa (DAO), que cataliza muy eficazmente la oxidación de diaminas (como la putrescina y cadaverina), y la Tiramina Oxidasa (TAO), que hace lo propio con la tiramina (e histamina). Estas enzimas son cobre-dependientes, es decir, contienen coenzimas constituidos por diferentes compuestos de cobre. El objetivo era ver si durante las reacciones enzimáticas se producían cambios en las propiedades de absorción/fluorescencia de estos compuestos de cobre y en estudiar su posible aprovechamiento en el desarrollo de biosensores para AB. Se disponía de resultados preliminares, realizados en esta Tesis, en los que se había desarrollado un biosensor para la determinación de dopamina (una AB neurotransmisora) usando la enzima Lacasa, que es también cobre-dependiente (ver Apéndice 2), por lo que lo que la hipótesis de partida parecía razonable.
Sin embargo, tal como se expone en el capítulo 3 los resultados que se obtuvieron con DAO (y TAO) en disolución acuosa no ofrecieron una sensibilidad lo suficientemente alta como para justificar estudios dirigidos a su implementación en biosensores y su aplicación en muestras reales. Para paliar esta falta de sensibilidad se acopló la Peroxidasa (HRP) sobre la reacción (1). Los resultados obtenidos con esta enzima permitieron mejorar la sensibilidad, pero surgieron problemas relacionados con el mecanismo y las interferencias (se describen también en el capítulo 3) que impidieron su aplicación sobre muestras reales.
Descartado el uso de las propiedades intrínsecas de las enzimas, se optó por buscar metodologías alternativas basadas en el uso de reacciones indicadoras acopladas a la reacción (1). Se abrieron dos alternativas que se fueron desarrollando prácticamente en paralelo y que conforman las dos secciones principales de esta Tesis Doctoral.
La primera de ellas, que se describe en la sección A, consistió en acoplar una reacción indicadora para determinar el H2O2 formado, basada en el uso de la peroxidasa (HRP) y un colorante, según:
H2O2 + Colorante -->HRP --> Colorante oxidado + H2O (2)
El objetivo era también que la metodología se pudiera implementar en un biosensor monouso (tiras reactivas) y usarlo como método de criba visual (o de imagen) para las ABs. Se trata de un método enzimático clásico, donde los colorantes habituales son ABTS y TMB. En realidad, se pensaba que ya existirían metodos para ABs basados en este tipo de reacciones, pero apenas se encontró información bibliográfica. Además, durante el desarrollo del método para Put y Cad con DAO y HRP/ABTS, se obtuvieron una serie de resultados que permitieron aportar nueva información sobre los mecanismos de reacción y aparición del color, procesos interferenciales y metodologías alternativas de trabajo (capítulo 6). Además, por el color formado (azul-verdoso), su uso en tiras reactivas de celulosa resultó no ser el más conveniente, por lo que se sustituyó para este objetivo por TMB, el cuál fue estudiado en paralelo en el grupo de investigación y aplicado directamente a tiras reactivas en esta tesis (capítulo 7).
La segunda alternativa, que corresponde a la sección B, constituye el núcleo más novedoso de esta Tesis. Consistió en sustituir la reacción indicadora (2), por Au(III) como único reactivo auxiliar con el objeto de que se formaran nanopartículas como consecuencia de la reacción enzimática. Esto suponía un reto metodológico, ya que su utilización como regenerador del ciclo catalítico de enzimas y su consecuente formación de nanopartículas in situ no había sido descrito previamente. El objetivo era, no solo diseñar una nueva alternativa indicadora general, sino también simplificar la reacción indicadora, eliminar el HRP y el colorante (evitando así posibles todas las dificultades derivadas de su uso) y evaluar otras posibles ventajas adicionales de su utilización. En el capítulo 9 se describe el mecanismo del uso del Au(III) en la reacción de la Tiramina oxidasa (TAO) y su utilización como método colorimétrico para tiramina. En el capítulo 10 se extrapoló esta metodología en la reacción de la DAO, para así verificar y establecer su uso como una posible nueva vía para la determinación enzimática de diferentes analitos.
Por último, y no menos importante, a raíz del uso del Au(III) en la reacción de la TAO, se observaron señales de fluorescencia en los blancos de reacción, las cuales se asociaron inicialmente a la formación de nanoestructuras de oro previas a la formación de nanopartículas de oro. Este hecho suscitó mucho interés en el desarrollo de esta tesis, por lo que se siguió investigando en esta línea, y tal como se describe en el capítulo 11, se han obtenido unos nanoclusters que permiten la determinación de tiramina sin necesidad de la utilización de TAO.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: química
Titulación: Programa de Doctorado en Ciencia Analítica en Química
Plan(es): Plan 487
Nota: Presentado: 21 01 2022
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2022
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