Betancor Caro, Marina
Bolea Bailo, Rosa María (dir.) ; Badiola Díez, Juan José (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Abstract: Las enfermedades priónicas son trastornos neurodegenerativos mortales que no se pueden prevenir o tratar, por lo que actualmente muchas de las investigaciones en torno a estas enfermedades se centran en el desarrollo de tratamientos específicos. Se considera que parte de la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades priónicas se debe a la activación de la apoptosis y la alteración de la homeostasis de mecanismos autofágicos. El fragmento C-terminal no tóxico de la toxina tetánica (TTC) se ha descrito como una molécula neuroprotectora que se une a los receptores Trk desencadenando vías de supervivencia neuronal, inhibiendo la apoptosis y regulando la autofagia. Debido a esto, en el estudio número 1 de esta tesis, se presenta un estudio piloto para probar el potencial terapéutico del TTC en las enfermedades priónicas. Ratones wild type de la línea C57BL6 y ratones transgénicos Tg338, que sobreexpresan la PrPC ovina en su variante VRQ/VRQ, se inocularon intracerebralmente con el agente priónico del scrapie y luego fueron tratados mediante la inyección intramuscular de TTC. Los resultados de este estudio muestran, en el grupo tratado de ambos modelos murinos, una disminución de las proteínas caspasa-3 y p62 y un aumento de LC3B y NeuN a nivel encefálico. Además, los ratones wild type tratados mostraron diferencias en la regulación de la expresión génica de Atg5, Becn1 y Fbxw7. Así, se observa que la inyección de TTC generó efectos neuroprotectores en ambos modelos murinos de enfermedad priónica a través de la reducción de la apoptosis y de la regulación de la autofagia, lo que resultó en un aumento de la supervivencia neuronal, pese a no aumentar el tiempo de supervivencia. Estos hallazgos refuerzan el papel del TTC como regulador de la apoptosis y la autofagia en enfermedades neurodegenerativas y, lo que es más importante, como molécula neuroprotectora.
Otro de los principales focos de las investigaciones actuales en enfermedades priónicas está en la búsqueda de biomarcadores que permitan detectar la enfermedad en fases preclínicas. La neurogranina (Ng) y la cadena ligera del neurofilamento (NfL) son proteínas que reflejan el daño sináptico y axonal y se postulan como buenos biomarcadores para trastornos neurodegenerativos. En el estudio número 2, se evalúan Ng y NfL como posibles biomarcadores preclínicos en la enfermedad de scrapie. Para esto, se estudia tanto su concentración proteica como su nivel de expresión génica en el sistema nervioso central (SNC) de ovejas afectadas por scrapie en estadios preclínico y clínico, en comparación con controles sanos. Además, se evalúan también sus niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) y su correlación con los principales eventos neuropatológicos en las enfermedades priónicas, el depósito de PrPSc y la espongiosis. Los resultados muestran una disminución en los niveles de expresión proteica y génica de Ng y NfL a medida que avanza la enfermedad, y cambios significativos entre los animales del grupo control y preclínico. Por el contrario, los niveles de LCR de NfL aumentaron a lo largo de la progresión de la enfermedad. Además, se encontró una correlación negativa entre los marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica y la concentración de las proteínas estudiadas. Así, en este estudio se corrobora que la concentración en el tejido nervioso de Ng y NfL, marcadores de daño sináptico y axonal, se ve afectada por la acumulación de priones, y que esta condición es detectable incluso en etapas preclínicas enfermedad priónica. Por lo tanto, los resultados obtenidos respaldan la utilidad de ambas proteínas como biomarcadores preclínicos para enfermedades priónicas.
Los priones son patógenos exclusivamente proteicos cuya estructura terciaria y cuaternaria puede diferir, dando lugar a la aparición de diferentes cepas, que se manifiestan a través de variabilidad fenotípica. Además, la capacidad de transmisión de los priones a las diferentes especies está íntimamente ligada con sus características de cepa. Ampliar el conocimiento y la caracterización de las cepas priónicas es crucial para evaluar el potencial de los priones para infectar distintas especies, y para el control y la erradicación de las enfermedades priónicas. En el scrapie, se ha visto que varias cepas pueden propagarse a partir de un mismo aislado, por lo que se considera que, en ciertos casos, distintas cepas coexisten en el aislado original. Por esto, en el estudio número 3, se evalúa, mediante la técnica de Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), la presencia de cepas de scrapie asociadas a un perfil de 21kDa en aislados de origen ovino y su evolución durante su transmisión seriada en un bioensayo en ratones que expresan la PrPC ovina. Para esto, se utilizó la PMCA en diferentes condiciones para evaluar la cantidad y proporción de subcomponentes contenidos en distintas muestras del bioensayo. Los resultados muestran que la PMCA se puede utilizar en determinadas condiciones en las que el fenotipo de 19kDa, asociado a una cepa de scrapie, no es amplificable. Bajo estas mismas condiciones, la PMCA es capaz de amplificar el subcomponente de 21kDa del scrapie, asociado a varias cepas distintas de esta enfermedad. A partir del método de PMCA establecido en este estudio, además, se detecta el componente de 21kDa en aislados de scrapie ovino que mostraban en un inicio un perfil de glicosilación de 19kDa. Por tanto, los resultados demuestran, por un lado, que la PMCA se puede utilizar para detectar cepas de 21kDa en homogeneizados que muestran una firma de 19kDa, y también que es capaz de detectar la selección diferencial dependiente del tejido que ocurre en los bioensayos. Por otro lado, y de forma más importante, los resultados sugieren que algunos aislados naturales de scrapie ovino utilizados en el estudio contenían mezclas de cepas y que la coinfección con varias cepas podría ocurrir de forma frecuente en la naturaleza.
La generación in vitro de priones recombinantes infecciosos fue un gran logro en la investigación de las enfermedades priónicas ya que permite la producción de PrP recombinante de alta pureza para su uso en futuras investigaciones. Sin embargo, estos priones recombinantes pueden existir y propagarse en muchas conformaciones que pueden diferir en su patogenicidad y ser desde absolutamente inocuas hasta letales, lo que limita su uso como buenos modelos de priones. La generación de priones recombinantes que retengan las características de los priones de mamífero es de crucial importancia, ya que el conocimiento obtenido de los estudios con priones recombinantes podría ayudar a comprender los aspectos desconocidos de la patogénesis de las enfermedades priónicas. En el estudio número 4 de esta tesis, se analizan comparativamente las características de distintas cepas priónicas de mamífero y de sus homólogas recombinantes tras su bioensayo en el modelo TgVole, con el fin de determinar cómo varían sus propiedades biológicas tras propagarse in vitro sobre una proteína recombinante y posteriormente in vivo. Tras la inoculación de las cepas de mamífero de scrapie 22L, RML, 263K y ME7, así como de cepas recombinantes homólogas de éstas en el modelo transgénico TgVole, que expresa la PrPC 109I del bank vole, todas fueron capaces de producir enfermedad en los animales. Además, las cepas recombinantes 22L-PMSA-2 y RML-PMSA-1, obtenidas tras la replicación in vitro de las cepas naturales 22L y RML respectivamente, mostraron una gran similitud con sus homólogas naturales en las características neuropatológicas asociadas a la infección por priones (espongiosis y depósito de PrPSc). Aunque este estudio se completará en el futuro con el análisis de las propiedades bioquímicas de estas cepas, los resultados obtenidos implican que estas dos cepas de scrapie mantienen sus propiedades neuropatológicas tras su propagación en proteína recombinante, y que por lo tanto podrían ser buenos modelos para posteriores estudios.
Los cuatro estudios desarrollados en esta tesis han cumplido los objetivos de la misma, ampliando el conocimiento actual tanto sobre la patogenia, diagnóstico y tratamiento de las enfermedades priónicas como de los priones como agentes patógenos.
Abstract (other lang.):
Otro de los principales focos de las investigaciones actuales en enfermedades priónicas está en la búsqueda de biomarcadores que permitan detectar la enfermedad en fases preclínicas. La neurogranina (Ng) y la cadena ligera del neurofilamento (NfL) son proteínas que reflejan el daño sináptico y axonal y se postulan como buenos biomarcadores para trastornos neurodegenerativos. En el estudio número 2, se evalúan Ng y NfL como posibles biomarcadores preclínicos en la enfermedad de scrapie. Para esto, se estudia tanto su concentración proteica como su nivel de expresión génica en el sistema nervioso central (SNC) de ovejas afectadas por scrapie en estadios preclínico y clínico, en comparación con controles sanos. Además, se evalúan también sus niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) y su correlación con los principales eventos neuropatológicos en las enfermedades priónicas, el depósito de PrPSc y la espongiosis. Los resultados muestran una disminución en los niveles de expresión proteica y génica de Ng y NfL a medida que avanza la enfermedad, y cambios significativos entre los animales del grupo control y preclínico. Por el contrario, los niveles de LCR de NfL aumentaron a lo largo de la progresión de la enfermedad. Además, se encontró una correlación negativa entre los marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica y la concentración de las proteínas estudiadas. Así, en este estudio se corrobora que la concentración en el tejido nervioso de Ng y NfL, marcadores de daño sináptico y axonal, se ve afectada por la acumulación de priones, y que esta condición es detectable incluso en etapas preclínicas enfermedad priónica. Por lo tanto, los resultados obtenidos respaldan la utilidad de ambas proteínas como biomarcadores preclínicos para enfermedades priónicas.
Los priones son patógenos exclusivamente proteicos cuya estructura terciaria y cuaternaria puede diferir, dando lugar a la aparición de diferentes cepas, que se manifiestan a través de variabilidad fenotípica. Además, la capacidad de transmisión de los priones a las diferentes especies está íntimamente ligada con sus características de cepa. Ampliar el conocimiento y la caracterización de las cepas priónicas es crucial para evaluar el potencial de los priones para infectar distintas especies, y para el control y la erradicación de las enfermedades priónicas. En el scrapie, se ha visto que varias cepas pueden propagarse a partir de un mismo aislado, por lo que se considera que, en ciertos casos, distintas cepas coexisten en el aislado original. Por esto, en el estudio número 3, se evalúa, mediante la técnica de Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), la presencia de cepas de scrapie asociadas a un perfil de 21kDa en aislados de origen ovino y su evolución durante su transmisión seriada en un bioensayo en ratones que expresan la PrPC ovina. Para esto, se utilizó la PMCA en diferentes condiciones para evaluar la cantidad y proporción de subcomponentes contenidos en distintas muestras del bioensayo. Los resultados muestran que la PMCA se puede utilizar en determinadas condiciones en las que el fenotipo de 19kDa, asociado a una cepa de scrapie, no es amplificable. Bajo estas mismas condiciones, la PMCA es capaz de amplificar el subcomponente de 21kDa del scrapie, asociado a varias cepas distintas de esta enfermedad. A partir del método de PMCA establecido en este estudio, además, se detecta el componente de 21kDa en aislados de scrapie ovino que mostraban en un inicio un perfil de glicosilación de 19kDa. Por tanto, los resultados demuestran, por un lado, que la PMCA se puede utilizar para detectar cepas de 21kDa en homogeneizados que muestran una firma de 19kDa, y también que es capaz de detectar la selección diferencial dependiente del tejido que ocurre en los bioensayos. Por otro lado, y de forma más importante, los resultados sugieren que algunos aislados naturales de scrapie ovino utilizados en el estudio contenían mezclas de cepas y que la coinfección con varias cepas podría ocurrir de forma frecuente en la naturaleza.
La generación in vitro de priones recombinantes infecciosos fue un gran logro en la investigación de las enfermedades priónicas ya que permite la producción de PrP recombinante de alta pureza para su uso en futuras investigaciones. Sin embargo, estos priones recombinantes pueden existir y propagarse en muchas conformaciones que pueden diferir en su patogenicidad y ser desde absolutamente inocuas hasta letales, lo que limita su uso como buenos modelos de priones. La generación de priones recombinantes que retengan las características de los priones de mamífero es de crucial importancia, ya que el conocimiento obtenido de los estudios con priones recombinantes podría ayudar a comprender los aspectos desconocidos de la patogénesis de las enfermedades priónicas. En el estudio número 4 de esta tesis, se analizan comparativamente las características de distintas cepas priónicas de mamífero y de sus homólogas recombinantes tras su bioensayo en el modelo TgVole, con el fin de determinar cómo varían sus propiedades biológicas tras propagarse in vitro sobre una proteína recombinante y posteriormente in vivo. Tras la inoculación de las cepas de mamífero de scrapie 22L, RML, 263K y ME7, así como de cepas recombinantes homólogas de éstas en el modelo transgénico TgVole, que expresa la PrPC 109I del bank vole, todas fueron capaces de producir enfermedad en los animales. Además, las cepas recombinantes 22L-PMSA-2 y RML-PMSA-1, obtenidas tras la replicación in vitro de las cepas naturales 22L y RML respectivamente, mostraron una gran similitud con sus homólogas naturales en las características neuropatológicas asociadas a la infección por priones (espongiosis y depósito de PrPSc). Aunque este estudio se completará en el futuro con el análisis de las propiedades bioquímicas de estas cepas, los resultados obtenidos implican que estas dos cepas de scrapie mantienen sus propiedades neuropatológicas tras su propagación en proteína recombinante, y que por lo tanto podrían ser buenos modelos para posteriores estudios.
Los cuatro estudios desarrollados en esta tesis han cumplido los objetivos de la misma, ampliando el conocimiento actual tanto sobre la patogenia, diagnóstico y tratamiento de las enfermedades priónicas como de los priones como agentes patógenos.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: biología molecular ; ciencias veterinarias ; neuropatología ; neurociencias
Titulación: Programa de Doctorado en Medicina y Sanidad Animal
Plan(es): Plan 498
Knowledge area: Salud
Nota: Presentado: 03 03 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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