Miguel Jiménez, Sara
Pérez Pe, Rosaura María (dir.) ; Casao Gascón, Adriana (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Resumen: La especie ovina tiene una estacionalidad reproductiva muy marcada que está regida por la secreción de melatonina. Dado que esta estacionalidad resulta limitante para la producción ovina, un sector fundamental por su importancia económica, social y medioambiental, un conocimiento más profundo de la acción de la melatonina sobre la reproducción ovina permitiría mejorar su eficiencia reproductiva.
La melatonina se sintetiza en la glándula pineal y ejerce sus principales efectos sobre la reproducción a través de la regulación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal. No obstante, también existe producción de melatonina extrapineal en varios órganos y tejidos, entre ellos los del tracto reproductor femenino y masculino. Se encuentra en el fluido folicular y es secretada por las células del cumulus que rodean al ovocito. Además, esta hormona está presente en el plasma seminal del morueco a una concentración variable a lo largo del año, en función de la estación reproductiva. La melatonina tiene acción antioxidante y además puede ejercer efectos directos sobre los espermatozoides a través de su unión a receptores específicos en la membrana plasmática (MT1 y MT2). Entre sus efectos se han descrito una acción antiapoptótica y un papel regulador sobre la capacitación espermática in vitro. Para algunas células somáticas, también se ha referido un efecto quimiotáctico de la melatonina. En base a estos antecedentes, en esta tesis se planteó como hipótesis que la melatonina es capaz de actuar como quimioatrayente y modular la orientación espermática en la especie ovina, y que además ejerce un efecto antioxidante y antiapoptótico durante el proceso de capacitación espermática.
La quimiotaxis como mecanismo de orientación espermática en mamíferos se ha reconocido ampliamente en los últimos años, excluyendo la idea de que es un mecanismo propio de especies acuáticas con fertilización externa. Un aspecto a tener en cuenta es que, según estudios previos, solo los espermatozoides capacitados e hiperactivados son capaces de responder a los estímulos quimiotácticos. En algunas especies, como el humano, el toro, el ratón o el cerdo, se ha demostrado la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides al fluido folicular; sin embargo, no está claro qué sustancias de este fluido son las responsables de ejercer dicha quimioatracción. Las hormonas esteroideas, como la progesterona o el estradiol, parecen ser esenciales en la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides, además de otras sustancias no hormonales. Otra hormona presente en el fluido folicular y en el tracto reproductor de la hembra es la melatonina, y dado que se ha visto que tiene un efecto quimiotáctico sobre algunas células somáticas, podría ser una hormona candidata a modular los procesos de orientación espermática hacia el ovocito. Para comprobarlo, el primer objetivo de este trabajo fue analizar el efecto quimiotáctico in vitro de la melatonina sobre la orientación de los espermatozoides ovinos, como una aproximación a lo que ocurriría in vivo en el tracto genital femenino de esta especie. En primer lugar, se evaluó el efecto de la melatonina mediante un método de selección espermática, el swim-up/dextrano, añadiéndola en la capa superior del medio de recogida a dos concentraciones distintas, 100 pM y 1 µM. El porcentaje de recuperación de células en la capa superior del medio de swim-up fue mayor en presencia de melatonina a ambas concentraciones, pero solamente para espermatozoides obtenidos durante la época no reproductiva. Además, los espermatozoides seleccionados con melatonina 100 pM estaban más capacitados y presentaban un mayor marcaje para el receptor MT2 en el acrosoma en comparación con los recuperados en el swim-up control. El mayor porcentaje de recuperación obtenido en presencia de melatonina podría deberse al estímulo del movimiento espermático en direcciones aleatorias (quimioquinesis), o a un movimiento dirigido (quimiotaxis) hacia la melatonina. Para tratar de dilucidar esta cuestión, se llevó a cabo otro abordaje experimental utilizando cámaras de quimiotaxis comerciales y un software de acceso libre, el OpenCASA, que analiza las trayectorias individuales de los espermatozoides hacia el quimioatrayente y calcula un índice de quimiotaxis (índice SL). De nuevo, se observaron diferencias significativas únicamente durante la época no reproductiva, probablemente debido a que la exposición de los espermatozoides a las altas concentraciones de melatonina en el plasma seminal durante la época reproductiva enmascare los efectos in vitro de esta hormona. En este caso, solo los espermatozoides capacitados en presencia de altos niveles de AMPc respondieron al estímulo quimiotáctico de la melatonina a concentración 1 µM. Estos resultados (artículo 1) apuntarían a una acción quimiotáctica de la melatonina in vitro sobre los espermatozoides ovinos, abriendo la posibilidad de incluir esta hormona en el método de swim-up para mejorar la tasa de recuperación espermática.
El segundo objetivo general de esta tesis doctoral fue profundizar en los mecanismos moleculares de respuesta de los espermatozoides ovinos a la melatonina durante los procesos de capacitación y apoptosis, poniendo especial atención a su papel antioxidante. Hay que tener en cuenta que la capacitación en la especie ovina puede ser estimulada in vitro por la adición de compuestos que incrementan el AMPc (vía clásica AMPc/PKA) o por la presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (vía de las MAP quinasas). Para que la capacitación espermática tenga lugar, es necesario que haya ciertos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), pero sin que se produzcan en exceso, ya que resultaría perjudicial. La producción de ROS en los espermatozoides es posible gracias a la implicación de varias enzimas. Por ello, dentro de este segundo objetivo general, se planteó como primer objetivo específico estudiar la generación del anión superóxido y del óxido nítrico en los espermatozoides ovinos y su implicación en la capacitación espermática. Los resultados obtenidos demostraron, por primera vez, la existencia de las enzimas NADPH oxidasa 5 (NOX5, productora de superóxidos) y óxido nítrico sintasa (NOS, productora de óxido nítrico) en el espermatozoide ovino, describiendo su localización, así como su implicación en la capacitación espermática ovina (artículos 2 y 3).
En espermatozoides ovinos se identificaron seis inmunotipos de NOX5 mediante inmunofluorescencia indirecta, cuyos porcentajes variaron durante la capacitación in vitro, observándose, al mismo tiempo, un aumento en los niveles intracelulares de superóxidos. Éstos últimos también aumentaron tras la adición de ionóforo de calcio, ya que la NOX5 es sensible a este ion, y disminuyeron en presencia de un inhibidor de NOX5 (GKT136901), junto con el porcentaje de espermatozoides capacitados y con el acrosoma reaccionado. Estos resultados demostrarían que la NOX5 es una importante fuente de ROS en el espermatozoide ovino y estaría implicada en el proceso de capacitación (artículo 2).
Por su parte, se detectaron las tres isoformas de NOS (eNOS, nNOS e iNOS) en los espermatozoides ovinos. Las formas constitutivas, eNOS y nNOS, se detectaron por inmunofluorescencia y western blot, mientras que la inducible, iNOS, sólo mediante inmunofluorescencia. Para cada isoforma se describieron dos inmunotipos, cuyos porcentajes cambiaron durante la capacitación in vitro con agentes elevadores del AMPc (artículo 3). También los niveles de óxido nítrico fueron mayores en los espermatozoides incubados en condiciones capacitantes, tanto con agentes elevadores del AMPc (artículo 3) como con EGF (artículo 4). Estos resultados, junto con los obtenidos tras la adición de un precursor del óxido nítrico, la L-arginina, y un inhibidor de la NOS, el L-NAME, sugieren la implicación de la NOS y el óxido nítrico en la capacitación espermática ovina.
El segundo objetivo específico dentro del segundo objetivo general fue analizar el efecto de la melatonina sobre los niveles de óxido nítrico y superóxidos durante la capacitación in vitro en los espermatozoides ovinos. Así, la incubación de los espermatozoides con melatonina 1 µM limitó la producción de superóxidos y evitó los cambios en la distribución de NOX5 asociados a la capacitación in vitro por alto AMPc, lo que demostraría que la melatonina ejercería su acción antioxidante en los espermatozoides ovinos, al menos en parte, mediante la modulación de la NOX5 durante la capacitación (artículo 2). Por otro lado, la presencia de melatonina modificó la distribución de la NOS durante la capacitación con elevadores del AMPc en los espermatozoides de morueco, pero no tuvo efectos significativos sobre los niveles de óxido nítrico (artículo 3). Tampoco tuvo efecto significativo sobre niveles de óxido nítrico cuando la capacitación in vitro se llevó a cabo con EGF, pero a concentración 1 µM fue capaz de inhibir el incremento de espermatozoides con el acrosoma reaccionado provocado por la L-arg (artículo 4).
Con respecto a la capacitación estimulada por la presencia del EGF, ésta implica la unión a su receptor (EGFR) y la activación de la ruta las MAP quinasas (MAPKs, del inglés Mitogen-Activated Protein Kinases). Esta ruta comparte mecanismos moleculares con la apoptosis en los espermatozoides ovinos, a través de la activación de la MAPK JNK (quinasa c-Jun N-terminal) y la p38.
A su vez, la capacidad antiapoptótica de la melatonina está relacionada, según estudios previos, con su efecto antioxidante a través la ruta las MAPKs. Esta ruta es una de las vías de actuación del óxido nítrico, que está implicado en la capacitación espermática ovina, como se ha demostrado en el primer objetivo específico. Por tanto, se planteó como tercer objetivo específico, dentro del segundo objetivo general, estudiar la implicación del óxido nítrico y la melatonina sobre la apoptosis durante la capacitación in vitro inducida por el EGF.
Los resultados obtenidos evidenciaron cambios relacionados con el proceso de apoptosis tras la inducción de la capacitación in vitro con EGF, ya que se detectó un aumento de los marcadores de apoptosis (activación de caspasas y fragmentación del ADN) por citometría de flujo, y un aumento de la forma activa de la MAPK JNK mediante western blot (artículo 4). Sin embargo, la inducción de la producción de óxido nítrico con L-arginina, aunque produjo un aumento en el porcentaje de espermatozoides reaccionados, no tuvo ningún efecto sobre los marcadores de apoptosis, lo que sugiere que el metabolismo del óxido nítrico no regula los procesos apoptóticos durante la capacitación espermática ovina inducida por el EGF. Por su parte, la melatonina mostró un efecto bimodal similar al que ejercía en otras condiciones capacitantes, previniendo la capacitación a concentración micromolar, y potenciando la reacción acrosómica a concentración picomolar. No obstante, no se observaron efectos significativos de la melatonina en relación a los marcadores de apoptosis aumentados por la capacitación, aunque que fue capaz de limitar la activación de la JNK por fosforilación (artículo 4).
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral proporcionan nuevos datos sobre los mecanismos moleculares involucrados en la capacitación espermática en la especie ovina, tanto por la vía clásica AMPc/PKA como por la vía del EGF, así como la implicación de la melatonina en este proceso y en la orientación espermática.
Resumen (otro idioma):
La melatonina se sintetiza en la glándula pineal y ejerce sus principales efectos sobre la reproducción a través de la regulación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal. No obstante, también existe producción de melatonina extrapineal en varios órganos y tejidos, entre ellos los del tracto reproductor femenino y masculino. Se encuentra en el fluido folicular y es secretada por las células del cumulus que rodean al ovocito. Además, esta hormona está presente en el plasma seminal del morueco a una concentración variable a lo largo del año, en función de la estación reproductiva. La melatonina tiene acción antioxidante y además puede ejercer efectos directos sobre los espermatozoides a través de su unión a receptores específicos en la membrana plasmática (MT1 y MT2). Entre sus efectos se han descrito una acción antiapoptótica y un papel regulador sobre la capacitación espermática in vitro. Para algunas células somáticas, también se ha referido un efecto quimiotáctico de la melatonina. En base a estos antecedentes, en esta tesis se planteó como hipótesis que la melatonina es capaz de actuar como quimioatrayente y modular la orientación espermática en la especie ovina, y que además ejerce un efecto antioxidante y antiapoptótico durante el proceso de capacitación espermática.
La quimiotaxis como mecanismo de orientación espermática en mamíferos se ha reconocido ampliamente en los últimos años, excluyendo la idea de que es un mecanismo propio de especies acuáticas con fertilización externa. Un aspecto a tener en cuenta es que, según estudios previos, solo los espermatozoides capacitados e hiperactivados son capaces de responder a los estímulos quimiotácticos. En algunas especies, como el humano, el toro, el ratón o el cerdo, se ha demostrado la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides al fluido folicular; sin embargo, no está claro qué sustancias de este fluido son las responsables de ejercer dicha quimioatracción. Las hormonas esteroideas, como la progesterona o el estradiol, parecen ser esenciales en la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides, además de otras sustancias no hormonales. Otra hormona presente en el fluido folicular y en el tracto reproductor de la hembra es la melatonina, y dado que se ha visto que tiene un efecto quimiotáctico sobre algunas células somáticas, podría ser una hormona candidata a modular los procesos de orientación espermática hacia el ovocito. Para comprobarlo, el primer objetivo de este trabajo fue analizar el efecto quimiotáctico in vitro de la melatonina sobre la orientación de los espermatozoides ovinos, como una aproximación a lo que ocurriría in vivo en el tracto genital femenino de esta especie. En primer lugar, se evaluó el efecto de la melatonina mediante un método de selección espermática, el swim-up/dextrano, añadiéndola en la capa superior del medio de recogida a dos concentraciones distintas, 100 pM y 1 µM. El porcentaje de recuperación de células en la capa superior del medio de swim-up fue mayor en presencia de melatonina a ambas concentraciones, pero solamente para espermatozoides obtenidos durante la época no reproductiva. Además, los espermatozoides seleccionados con melatonina 100 pM estaban más capacitados y presentaban un mayor marcaje para el receptor MT2 en el acrosoma en comparación con los recuperados en el swim-up control. El mayor porcentaje de recuperación obtenido en presencia de melatonina podría deberse al estímulo del movimiento espermático en direcciones aleatorias (quimioquinesis), o a un movimiento dirigido (quimiotaxis) hacia la melatonina. Para tratar de dilucidar esta cuestión, se llevó a cabo otro abordaje experimental utilizando cámaras de quimiotaxis comerciales y un software de acceso libre, el OpenCASA, que analiza las trayectorias individuales de los espermatozoides hacia el quimioatrayente y calcula un índice de quimiotaxis (índice SL). De nuevo, se observaron diferencias significativas únicamente durante la época no reproductiva, probablemente debido a que la exposición de los espermatozoides a las altas concentraciones de melatonina en el plasma seminal durante la época reproductiva enmascare los efectos in vitro de esta hormona. En este caso, solo los espermatozoides capacitados en presencia de altos niveles de AMPc respondieron al estímulo quimiotáctico de la melatonina a concentración 1 µM. Estos resultados (artículo 1) apuntarían a una acción quimiotáctica de la melatonina in vitro sobre los espermatozoides ovinos, abriendo la posibilidad de incluir esta hormona en el método de swim-up para mejorar la tasa de recuperación espermática.
El segundo objetivo general de esta tesis doctoral fue profundizar en los mecanismos moleculares de respuesta de los espermatozoides ovinos a la melatonina durante los procesos de capacitación y apoptosis, poniendo especial atención a su papel antioxidante. Hay que tener en cuenta que la capacitación en la especie ovina puede ser estimulada in vitro por la adición de compuestos que incrementan el AMPc (vía clásica AMPc/PKA) o por la presencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (vía de las MAP quinasas). Para que la capacitación espermática tenga lugar, es necesario que haya ciertos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), pero sin que se produzcan en exceso, ya que resultaría perjudicial. La producción de ROS en los espermatozoides es posible gracias a la implicación de varias enzimas. Por ello, dentro de este segundo objetivo general, se planteó como primer objetivo específico estudiar la generación del anión superóxido y del óxido nítrico en los espermatozoides ovinos y su implicación en la capacitación espermática. Los resultados obtenidos demostraron, por primera vez, la existencia de las enzimas NADPH oxidasa 5 (NOX5, productora de superóxidos) y óxido nítrico sintasa (NOS, productora de óxido nítrico) en el espermatozoide ovino, describiendo su localización, así como su implicación en la capacitación espermática ovina (artículos 2 y 3).
En espermatozoides ovinos se identificaron seis inmunotipos de NOX5 mediante inmunofluorescencia indirecta, cuyos porcentajes variaron durante la capacitación in vitro, observándose, al mismo tiempo, un aumento en los niveles intracelulares de superóxidos. Éstos últimos también aumentaron tras la adición de ionóforo de calcio, ya que la NOX5 es sensible a este ion, y disminuyeron en presencia de un inhibidor de NOX5 (GKT136901), junto con el porcentaje de espermatozoides capacitados y con el acrosoma reaccionado. Estos resultados demostrarían que la NOX5 es una importante fuente de ROS en el espermatozoide ovino y estaría implicada en el proceso de capacitación (artículo 2).
Por su parte, se detectaron las tres isoformas de NOS (eNOS, nNOS e iNOS) en los espermatozoides ovinos. Las formas constitutivas, eNOS y nNOS, se detectaron por inmunofluorescencia y western blot, mientras que la inducible, iNOS, sólo mediante inmunofluorescencia. Para cada isoforma se describieron dos inmunotipos, cuyos porcentajes cambiaron durante la capacitación in vitro con agentes elevadores del AMPc (artículo 3). También los niveles de óxido nítrico fueron mayores en los espermatozoides incubados en condiciones capacitantes, tanto con agentes elevadores del AMPc (artículo 3) como con EGF (artículo 4). Estos resultados, junto con los obtenidos tras la adición de un precursor del óxido nítrico, la L-arginina, y un inhibidor de la NOS, el L-NAME, sugieren la implicación de la NOS y el óxido nítrico en la capacitación espermática ovina.
El segundo objetivo específico dentro del segundo objetivo general fue analizar el efecto de la melatonina sobre los niveles de óxido nítrico y superóxidos durante la capacitación in vitro en los espermatozoides ovinos. Así, la incubación de los espermatozoides con melatonina 1 µM limitó la producción de superóxidos y evitó los cambios en la distribución de NOX5 asociados a la capacitación in vitro por alto AMPc, lo que demostraría que la melatonina ejercería su acción antioxidante en los espermatozoides ovinos, al menos en parte, mediante la modulación de la NOX5 durante la capacitación (artículo 2). Por otro lado, la presencia de melatonina modificó la distribución de la NOS durante la capacitación con elevadores del AMPc en los espermatozoides de morueco, pero no tuvo efectos significativos sobre los niveles de óxido nítrico (artículo 3). Tampoco tuvo efecto significativo sobre niveles de óxido nítrico cuando la capacitación in vitro se llevó a cabo con EGF, pero a concentración 1 µM fue capaz de inhibir el incremento de espermatozoides con el acrosoma reaccionado provocado por la L-arg (artículo 4).
Con respecto a la capacitación estimulada por la presencia del EGF, ésta implica la unión a su receptor (EGFR) y la activación de la ruta las MAP quinasas (MAPKs, del inglés Mitogen-Activated Protein Kinases). Esta ruta comparte mecanismos moleculares con la apoptosis en los espermatozoides ovinos, a través de la activación de la MAPK JNK (quinasa c-Jun N-terminal) y la p38.
A su vez, la capacidad antiapoptótica de la melatonina está relacionada, según estudios previos, con su efecto antioxidante a través la ruta las MAPKs. Esta ruta es una de las vías de actuación del óxido nítrico, que está implicado en la capacitación espermática ovina, como se ha demostrado en el primer objetivo específico. Por tanto, se planteó como tercer objetivo específico, dentro del segundo objetivo general, estudiar la implicación del óxido nítrico y la melatonina sobre la apoptosis durante la capacitación in vitro inducida por el EGF.
Los resultados obtenidos evidenciaron cambios relacionados con el proceso de apoptosis tras la inducción de la capacitación in vitro con EGF, ya que se detectó un aumento de los marcadores de apoptosis (activación de caspasas y fragmentación del ADN) por citometría de flujo, y un aumento de la forma activa de la MAPK JNK mediante western blot (artículo 4). Sin embargo, la inducción de la producción de óxido nítrico con L-arginina, aunque produjo un aumento en el porcentaje de espermatozoides reaccionados, no tuvo ningún efecto sobre los marcadores de apoptosis, lo que sugiere que el metabolismo del óxido nítrico no regula los procesos apoptóticos durante la capacitación espermática ovina inducida por el EGF. Por su parte, la melatonina mostró un efecto bimodal similar al que ejercía en otras condiciones capacitantes, previniendo la capacitación a concentración micromolar, y potenciando la reacción acrosómica a concentración picomolar. No obstante, no se observaron efectos significativos de la melatonina en relación a los marcadores de apoptosis aumentados por la capacitación, aunque que fue capaz de limitar la activación de la JNK por fosforilación (artículo 4).
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral proporcionan nuevos datos sobre los mecanismos moleculares involucrados en la capacitación espermática en la especie ovina, tanto por la vía clásica AMPc/PKA como por la vía del EGF, así como la implicación de la melatonina en este proceso y en la orientación espermática.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: reproducción animal ; ovinos
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 03 03 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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Registro creado el 2023-07-27, última modificación el 2023-09-14
