Jiménez Alesanco, Ana
Velázquez Campoy, Adrián (dir.) ; Abián Franco, Olga María (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Abstract: El descubrimiento de fármacos es un proceso complejo que se centra en el desarrollo de nuevos compuestos que puedan utilizarse para tratar y aliviar enfermedades que actualmente carecen de tratamientos eficaces. La identificación de fármacos contra proteínas diana implicadas en el desarrollo de estas enfermedades es uno de los principales enfoques para combatirlas. Uno de los problemas sanitarios que más preocupa en la actualidad es el cáncer.
En esta Tesis Doctoral se utilizan diversas técnicas para la identificación de potentes compuestos candidatos contra dos proteínas diana: BFT-3, asociada al desarrollo de cáncer colorrectal (Capítulo I), y NUPR1, implicada en el desarrollo de cáncer de páncreas (Capítulo II).
El Capítulo I está relacionado con Bacteroides fragilis, una bacteria comensal en el colon humano. Sin embargo, en condiciones disbióticas, puede propiciarse el crecimiento de B. fragilis enterotoxigénicas (ETBF), que provocan afecciones tales como diarrea, bacteriemia anaerobia, enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer colorrectal. El principal factor de virulencia de ETBF es una metaloproteasa dependiente de zinc llamada toxina de B. fragilis (BFT), que daña la mucosa intestinal e inicia vías de señalización relacionadas con estas enfermedades. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en una isoforma de la BFT, la BFT-3. Tras una caracterización estructural para evaluar la importancia del zinc en la estructura plegada de BFT-3, se han identificado con éxito varios fármacos (compuestos MOA), aprobados por la FDA, como inhibidores alostéricos mediante una combinación de técnicas biofísicas, bioquímicas, estructurales, celulares y de modelos animales in vivo. Además, se ha desarrollado un nuevo modelo animal de infección de larvas de G. mellonella para infecciones por B. fragilis, y los resultados sugieren que este nuevo modelo animal podría actuar como un buen huésped para descubrir y evaluar nuevos antimicrobianos contra este patógeno. En resumen, estos hallazgos resultan prometedores para desarrollar tratamientos contra las infecciones crónicas causadas por B. fragilis, disminuyendo el riesgo de inflamación intestinal y el desarrollo de cáncer colorrectal. Estos compuestos también pueden optimizarse aún más para mejorar su afinidad, selectividad o biodisponibilidad. En conjunto, este enfoque permite desarrollar inhibidores altamente específicos de las afecciones enteropatógenas mediadas por ETBF.
El capítulo II está relacionado con el cáncer de páncreas, una enfermedad letal con una elevada tasa de mortalidad sin opciones de tratamiento eficaces para los pacientes. Se ha identificado una proteína relacionada con estrés celular, la proteína nuclear 1 (NUPR1), como factor esencial para el desarrollo y progresión de la enfermedad. Esta proteína es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) que posee una secuencia de localización nuclear (NLS) para permitir su translocación al núcleo. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en caracterizar cómo NUPR1 se transloca al núcleo celular y estudiar el papel de la Importina α3 (Impα3) en su transporte desde el citoplasma, empleando varios mutantes de la región NLS. Se ha observado que la región NLS de NUPR1 interacciona con Impα3 con gran afinidad, y esta unión se vio dificultada por la eliminación o fosforilación de algunos residuos clave de NUPR1. Además, se ha realizado una caracterización similar con un parálogo de NUPR1, la proteína NUPR1L, indicando que esta otra IDP también se une a Impα3 para ser translocada al núcleo celular. Estos hallazgos abren el camino para modelizar la translocación nuclear de proteínas desordenadas. Además, dado que existe una necesidad urgente de identificar inhibidores de NUPR1 novedosos y seguros, mediante una combinación de técnicas biofísicas, bioquímicas, celulares y de modelos animales in vivo, se ha identificado un nuevo compuesto (AJO14) que interacciona con NUPR1. Este compuesto tiene un potente efecto citotóxico in vitro al dirigirse específicamente a NUPR1. Respecto a los mecanismos moleculares de acción, induce muerte celular principalmente a través de procesos de apoptosis, necrosis y promueve un fuerte fallo del metabolismo asociado a una disminución de la producción de ATP. Además, AJO14 reduce el crecimiento tumoral de forma dosis dependiente en ratones xenoinjertados con PDAC sin mostrar efectos secundarios. En general, AJO14 representa un nuevo y potente inhibidor de NUPR1 para el tratamiento del cáncer de páncreas.
Abstract (other lang.): Drug discovery is a complex process which is focused on developing novel agents that can be used to treat and alleviate diseases that currently lack effective treatments. The identification of drugs against target proteins, involved in the development of diseases, is one of the main approaches to combat them. One of the health problems of greatest concern today is cancer. This Doctoral Thesis includes a combination of several techniques for the identification of potent candidate compounds against two target proteins: BFT-3, associated with colorectal cancer development (Chapter I), and NUPR1, involved in pancreatic cancer development (Chapter II). Chapter I is related to Bacteroides fragilis, a common commensal bacterium in the human colon. However, under dysbiotic conditions, enterotoxigenic B. fragilis (ETBF) can emerge, leading to conditions such as diarrhea, bacteremia, inflammatory bowel disease, and colorectal cancer. The primary virulence factor of ETBF is a zinc-dependent metalloprotease called B. fragilis toxin (BFT), which damages the intestinal mucosa and initiates disease-related signaling pathways. This Doctoral Thesis was focused on one isoform of BFT, BFT-3. After a structural characterization for evaluating the importance of the zinc for the folded structure of BFT-3, several approved drugs were successfully identified as allosteric inhibitors (MOA4, MOA9 and MOA10 compounds) through a combination of biophysical, biochemical, structural, cellular and in vivo animal model techniques. Furthermore, a novel animal model of G. mellonella larvae for B. fragilis infections has been developed, and the results suggest that this new animal model could act as a good host to discover and evaluate new antimicrobials against this pathogen. In summary, these findings show promise for developing treatments for chronic B. fragilis infections, diminishing the risk of intestinal inflammation and colorectal cancer development. These MOA compounds can also be further optimized to enhance their affinity, selectivity, or bioavailability. Overall, this approach offers a novel way for developing highly specific inhibitors of ETBF-mediated enteropathogenic conditions. Chapter II is related to pancreatic cancer, a fatal disease with a high mortality rate with no effective treatment options for patients. A cell stress-related protein, the nuclear protein 1 (NUPR1), has been identified as an essential factor for its development and progression. This protein is an intrinsically disordered protein (IDP) that has a nuclear localization sequence (NLS) to allow it for nuclear translocation. This Doctoral Thesis focused on characterizing how NUPR1 translocates to the cell nucleus, and studying the role of Importin ¿3 (Imp¿3) in its transport from the cytoplasm, by employing several mutants of the NLS region. The NLS region of NUPR1 interacted with Imp¿3 with high affinity, and this binding was hampered by the removal or phosphorylation of some key residues of NUPR1. Additionally, a similar characterization was performed with a paralogue of NUPR1, the NUPR1L protein, indicating that this other IDP also interacted with Imp¿3 as a mean of being translocated to the cell nucleus. These findings open the way to model the nuclear translocation of disordered proteins. Additionally, since there is an urgent need to identify novel and safe NUPR1 inhibitors, through a combination of biophysical, biochemical, cellular and in vivo animal model techniques, a new compound (AJO14) was identified as molecule binding to NUPR1. This compound exerted a potent cytotoxic effect in vitro by specifically targeting NUPR1. Regarding its mechanisms of actions, it induced cell death mainly through apoptosis, necrosis and promoting a strong metabolic failure with a decrease in ATP production. Furthermore, AJO14 showed an excellent dose-dependent tumor reduction activity on PDAC xenograft mice with no side effects. Overall, AJO14 represents a potent new NUPR1 inhibitor for the treatment of pancreatic cancer.
En esta Tesis Doctoral se utilizan diversas técnicas para la identificación de potentes compuestos candidatos contra dos proteínas diana: BFT-3, asociada al desarrollo de cáncer colorrectal (Capítulo I), y NUPR1, implicada en el desarrollo de cáncer de páncreas (Capítulo II).
El Capítulo I está relacionado con Bacteroides fragilis, una bacteria comensal en el colon humano. Sin embargo, en condiciones disbióticas, puede propiciarse el crecimiento de B. fragilis enterotoxigénicas (ETBF), que provocan afecciones tales como diarrea, bacteriemia anaerobia, enfermedad inflamatoria intestinal y cáncer colorrectal. El principal factor de virulencia de ETBF es una metaloproteasa dependiente de zinc llamada toxina de B. fragilis (BFT), que daña la mucosa intestinal e inicia vías de señalización relacionadas con estas enfermedades. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en una isoforma de la BFT, la BFT-3. Tras una caracterización estructural para evaluar la importancia del zinc en la estructura plegada de BFT-3, se han identificado con éxito varios fármacos (compuestos MOA), aprobados por la FDA, como inhibidores alostéricos mediante una combinación de técnicas biofísicas, bioquímicas, estructurales, celulares y de modelos animales in vivo. Además, se ha desarrollado un nuevo modelo animal de infección de larvas de G. mellonella para infecciones por B. fragilis, y los resultados sugieren que este nuevo modelo animal podría actuar como un buen huésped para descubrir y evaluar nuevos antimicrobianos contra este patógeno. En resumen, estos hallazgos resultan prometedores para desarrollar tratamientos contra las infecciones crónicas causadas por B. fragilis, disminuyendo el riesgo de inflamación intestinal y el desarrollo de cáncer colorrectal. Estos compuestos también pueden optimizarse aún más para mejorar su afinidad, selectividad o biodisponibilidad. En conjunto, este enfoque permite desarrollar inhibidores altamente específicos de las afecciones enteropatógenas mediadas por ETBF.
El capítulo II está relacionado con el cáncer de páncreas, una enfermedad letal con una elevada tasa de mortalidad sin opciones de tratamiento eficaces para los pacientes. Se ha identificado una proteína relacionada con estrés celular, la proteína nuclear 1 (NUPR1), como factor esencial para el desarrollo y progresión de la enfermedad. Esta proteína es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) que posee una secuencia de localización nuclear (NLS) para permitir su translocación al núcleo. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en caracterizar cómo NUPR1 se transloca al núcleo celular y estudiar el papel de la Importina α3 (Impα3) en su transporte desde el citoplasma, empleando varios mutantes de la región NLS. Se ha observado que la región NLS de NUPR1 interacciona con Impα3 con gran afinidad, y esta unión se vio dificultada por la eliminación o fosforilación de algunos residuos clave de NUPR1. Además, se ha realizado una caracterización similar con un parálogo de NUPR1, la proteína NUPR1L, indicando que esta otra IDP también se une a Impα3 para ser translocada al núcleo celular. Estos hallazgos abren el camino para modelizar la translocación nuclear de proteínas desordenadas. Además, dado que existe una necesidad urgente de identificar inhibidores de NUPR1 novedosos y seguros, mediante una combinación de técnicas biofísicas, bioquímicas, celulares y de modelos animales in vivo, se ha identificado un nuevo compuesto (AJO14) que interacciona con NUPR1. Este compuesto tiene un potente efecto citotóxico in vitro al dirigirse específicamente a NUPR1. Respecto a los mecanismos moleculares de acción, induce muerte celular principalmente a través de procesos de apoptosis, necrosis y promueve un fuerte fallo del metabolismo asociado a una disminución de la producción de ATP. Además, AJO14 reduce el crecimiento tumoral de forma dosis dependiente en ratones xenoinjertados con PDAC sin mostrar efectos secundarios. En general, AJO14 representa un nuevo y potente inhibidor de NUPR1 para el tratamiento del cáncer de páncreas.
Abstract (other lang.): Drug discovery is a complex process which is focused on developing novel agents that can be used to treat and alleviate diseases that currently lack effective treatments. The identification of drugs against target proteins, involved in the development of diseases, is one of the main approaches to combat them. One of the health problems of greatest concern today is cancer. This Doctoral Thesis includes a combination of several techniques for the identification of potent candidate compounds against two target proteins: BFT-3, associated with colorectal cancer development (Chapter I), and NUPR1, involved in pancreatic cancer development (Chapter II). Chapter I is related to Bacteroides fragilis, a common commensal bacterium in the human colon. However, under dysbiotic conditions, enterotoxigenic B. fragilis (ETBF) can emerge, leading to conditions such as diarrhea, bacteremia, inflammatory bowel disease, and colorectal cancer. The primary virulence factor of ETBF is a zinc-dependent metalloprotease called B. fragilis toxin (BFT), which damages the intestinal mucosa and initiates disease-related signaling pathways. This Doctoral Thesis was focused on one isoform of BFT, BFT-3. After a structural characterization for evaluating the importance of the zinc for the folded structure of BFT-3, several approved drugs were successfully identified as allosteric inhibitors (MOA4, MOA9 and MOA10 compounds) through a combination of biophysical, biochemical, structural, cellular and in vivo animal model techniques. Furthermore, a novel animal model of G. mellonella larvae for B. fragilis infections has been developed, and the results suggest that this new animal model could act as a good host to discover and evaluate new antimicrobials against this pathogen. In summary, these findings show promise for developing treatments for chronic B. fragilis infections, diminishing the risk of intestinal inflammation and colorectal cancer development. These MOA compounds can also be further optimized to enhance their affinity, selectivity, or bioavailability. Overall, this approach offers a novel way for developing highly specific inhibitors of ETBF-mediated enteropathogenic conditions. Chapter II is related to pancreatic cancer, a fatal disease with a high mortality rate with no effective treatment options for patients. A cell stress-related protein, the nuclear protein 1 (NUPR1), has been identified as an essential factor for its development and progression. This protein is an intrinsically disordered protein (IDP) that has a nuclear localization sequence (NLS) to allow it for nuclear translocation. This Doctoral Thesis focused on characterizing how NUPR1 translocates to the cell nucleus, and studying the role of Importin ¿3 (Imp¿3) in its transport from the cytoplasm, by employing several mutants of the NLS region. The NLS region of NUPR1 interacted with Imp¿3 with high affinity, and this binding was hampered by the removal or phosphorylation of some key residues of NUPR1. Additionally, a similar characterization was performed with a paralogue of NUPR1, the NUPR1L protein, indicating that this other IDP also interacted with Imp¿3 as a mean of being translocated to the cell nucleus. These findings open the way to model the nuclear translocation of disordered proteins. Additionally, since there is an urgent need to identify novel and safe NUPR1 inhibitors, through a combination of biophysical, biochemical, cellular and in vivo animal model techniques, a new compound (AJO14) was identified as molecule binding to NUPR1. This compound exerted a potent cytotoxic effect in vitro by specifically targeting NUPR1. Regarding its mechanisms of actions, it induced cell death mainly through apoptosis, necrosis and promoting a strong metabolic failure with a decrease in ATP production. Furthermore, AJO14 showed an excellent dose-dependent tumor reduction activity on PDAC xenograft mice with no side effects. Overall, AJO14 represents a potent new NUPR1 inhibitor for the treatment of pancreatic cancer.
Pal. clave: bioquímica ; proteínas ; evaluación de fármacos
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Knowledge area: Ciencias
Nota: Presentado: 10 11 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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