Expresión recombinante de enzimas oxidorreductasas en E. coli y Pichia pastoris.

Alierta Viñao, Cristina
Velasco Lozano, Susana (dir.)

Carrodeguas Villar, José Alberto (ponente)

Universidad de Zaragoza, CIEN, 2023

Máster en Biología Molecular y Celular

Resumen: En la naturaleza, la ferredoxina NADP-reductasa (FNR) es la principal flavoenzima capaz de regenerar NADPH recibiendo los electrones proporcionados por el fotosistema I y catalizando la reducción de dos electrones de NADP+ a NADPH. Esta capacidad catalítica ha sido aprovechada fuera de la célula en la llamada “e-leaf”. En estas condiciones, la FNR cataliza la interconversión reversible de NADPH en NADP+ cuando está confinada en la superficie de un electrodo. Además, este concepto bioelectrocatalítico se ha explotado como herramienta de regeneración de cofactores ensamblado con sistemas multienzimáticos que lo requieren. Entre las FNR reportadas, la de la cianobacteria Anabaena sp. (AsFNR) se ha expresado de forma recombinante en E. coli con rendimientos proteicos relativamente altos, lo que ha permitido estudiarla ampliamente y caracterizarla cinéticamente. A pesar de estas ventajas, AsFNR muestra una baja estabilidad (mantiene menos del 50% de su actividad después de una noche a 4 ºC). Este inconveniente dificulta su aplicación como sistema robusto de regeneración de cofactores en biotransformaciones a gran escala. Varias estrategias se han centrado en aumentar la estabilidad de esta enzima principalmente mediante inmovilización y mutaciones racionales.
Hoy en día, el sistema de expresión de levadura P. pastoris es una de las herramientas más populares y estándar para la producción de proteínas recombinantes en biología molecular. En general, los beneficios de esta estrategia incluyen un plegamiento correcto y la secreción de proteínas recombinantes en el entorno externo de la célula de levadura. La glicosilación es una de las formas más comunes de modificación postraduccional de proteínas en este sistema de expresión en levaduras; que está estrechamente relacionado con el aumento de la estabilidad térmica de las enzimas resultantes. Basándonos en estos descubrimientos previos, en el presente trabajo presentamos por primera vez la expresión heteróloga de AsFNR en P.pastoris con el objetivo de aumentar la estabilidad operativa de esta enzima mediante el proceso natural de modificaciones postraduccionales. Para ello, hemos clonado un constructo de AsFNR marcado con cola de histidinas extraído del vector pET28a insertándolo en un vector pGAPZαA. Tras la exitosa construcción del clon, optimizamos la expresión heteróloga de rAsFNR en P. pastoris en medio enriquecido para finalmente purificarla mediante cromatografía IMAC y caracterizarla cinéticamente. La rAsFNR obtenida exhibe la misma actividad específica, pero presenta mayor temperatura de fusión y mayor estabilidad operativa que la expresada en E. coli.

Tipo de Trabajo Académico: Trabajo Fin de Master