Cequier Soler, Alina
Romero Lasheras, Antonio (dir.) ; Rodellar Penella, Clementina (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2024
Abstract: Las células madre mesenquimales (MSCs) equinas son de gran interés en el campo de la medicina regenerativa, especialmente para el tratamiento de lesiones musculoesqueléticas. Debido a sus propiedades reguladoras, ejercidas a través de la secreción de diferentes moléculas, pueden ser también de gran utilidad en el tratamiento de enfermedades inflamatorias e inmunomediadas. Además, la posibilidad de utilizar MSCs alogénicas ha aumentado su atractivo, permitiendo su aplicación en etapas tempranas de la enfermedad y cuando existen limitaciones para la terapia autóloga. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las MSCs no son inmunoprivilegiadas y pueden generar respuesta inmune en el paciente alogénico, condicionando la efectividad de las terapias alogénicas. Existen diversos factores que pueden influir en dicho reconocimiento inmune de las MSCs alogénicas y, de hecho, algunas estrategias terapéuticas planteadas para potenciar su efecto pueden influir sobre las interacciones entre las MSCs alogénicas y el sistema inmune del receptor. Este sería el caso de la estimulación de las MSCs con citoquinas proinflamatorias, la administración de MSCs ya diferenciadas y la compatibilidad para el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) entre donante y receptor.
El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral fue estudiar cómo la inflamación y la diferenciación condrogénica afectan al equilibrio entre la capacidad inmunomoduladora e inmunogénica de las MSCs equinas, teniendo en cuenta la influencia de la compatibilidad para el MHC entre donante y receptor y eligiendo la especie equina por su importancia como paciente y como modelo animal. Para ello, se valoró la respuesta inmune frente a las MSCs tanto a nivel celular y humoral como local y sistémico, utilizando ensayos in vitro e in vivo, para caracterizar de forma completa dicha respuesta.
En primer lugar, se revisó el estado actual, las aplicaciones y las limitaciones de la utilización de las MSCs equinas en diferentes patologías y su potencial traslación como modelo animal para el estudio de diferentes enfermedades en la especie humana, entre las que destacan la uveítis recurrente, las afecciones fibroproliferativas de la piel y el asma.
En los ensayos in vitro llevados a cabo en la presente Tesis Doctoral se analizó la capacidad inmunomoduladora e inmunogénica de las MSCs equinas sin estimular (MSC-SE), estimuladas con citoquinas proinflamatorias (MSC-E) y diferenciadas a condrocito (MSC-C) al exponerlas in vitro a linfocitos de sangre periférica (PBL) autólogos, alogénicos MHC-compatibles y MHC-incompatibles. La estimulación de las MSCs activó su potencial regulador, reduciendo la proliferación de linfocitos T citotóxicos, T colaboradores y linfocitos B. Sin embargo, las MSC-E, especialmente en condiciones de incompatibilidad, mostraron una activación moderada del perfil inmunogénico y estimularon la proliferación de las células T citotóxicas y colaboradoras, aunque estos resultados fueron acompañados de una mayor activación de su perfil regulador. Tras la diferenciación condrogénica, las MSC-C equinas no perdieron su capacidad reguladora ni aumentaron su inmunogenicidad, aunque estimularon la proliferación de linfocitos B y mostraron una capacidad reducida para estimular los linfocitos T reguladores.
En el estudio in vivo, se administraron MSC-SE, MSC-E y MSC-C de forma autóloga, y en receptores MHC-compatibles y MHC-incompatibles. Las MSCs fueron encapsuladas en hidrogeles de alginato y se colocaron tres implantes subcutáneos con el mismo tipo de MSCs en las tablas del cuello de cada receptor. Los implantes se recuperaron a las 1, 3 y 6 semanas de su implantación para su análisis. Transcurrido un mes tras retirar el último de los implantes, se expuso nuevamente a cada animal al mismo tipo de MSCs en las tablas contralaterales del cuello para valorar el efecto de una segunda administración.
El análisis del perfil inmune de las MSCs recuperadas mostró que las MSC-C, tras ser administradas tanto en caballos MHC-compatibles como MHC-incompatibles, conservaban sus propiedades inmunomoduladoras a lo largo del tiempo. Además, la compatibilidad del MHC atenuó la respuesta inmune local inducida tras la administración, especialmente en las MSC-C y MSC-SE. Sin embargo, las MSC-SE administradas en caballos MHC-incompatibles mostraron un perfil inmunogénico más pronunciado y un menor perfil inmunomodulador, junto con una mayor respuesta inmunitaria local en comparación con el grupo MHC-compatible después de ambas administraciones. La administración de MSC-E indujo un reclutamiento local, temprano y pronunciado, de linfocitos, acompañado de una disminución en la expresión de genes relacionados con la inmunomodulación y un aumento de la expresión de genes relacionados con la inmunogenicidad.
La respuesta inmune celular sistémica y la generación de respuesta celular de memoria se evaluó reexponiendo in vitro los PBLs de los distintos receptores al tipo de MSCs que habían recibido de sus correspondientes donantes. Todos los tipos de MSCs MHC-incompatibles indujeron la proliferación de linfocitos T, pero este efecto fue más pronunciado y sostenido en el tiempo en las MSC-E, así como en las MSC-SE después de la segunda administración. Sin embargo, en situación MHC-incompatible, las MSC-E tuvieron menor efecto sobre los linfocitos B a lo largo del tiempo, siendo estos activados en mayor medida tanto por las MSC-C como por las MSC-SE.
En la valoración de la respuesta inmune humoral, los receptores autólogos y MHC-compatibles no desarrollaron anticuerpos contra el MHC del donante de MSCs, independientemente de tipo de MSCs que recibieron. Sin embargo, los caballos MHC-incompatibles desarrollaron aloanticuerpos después de la primera administración y su producción aumentó tras la segunda administración de las mismas MSCs. Aunque los tres tipos de MSCs indujeron el desarrollo de una respuesta inmune humoral en los receptores MHC-incompatibles, las MSC-C produjeron mayores niveles de aloanticuerpos, lo que podría relacionarse con la mayor activación de las células B mencionada anteriormente.
En conclusión, la exposición de las MSCs a citoquinas proinflamatorias activa el perfil inmunomodulador de las MSCs in vitro, aunque dicho perfil no se conserva in vivo. En cambio, prevalece un perfil inmunogénico que afecta negativamente a la capacidad inmunoevasiva de las MSC-E, sobre todo en condiciones de incompatibilidad para el MHC, lo que puede limitar su uso terapéutico.
En cuanto a la diferenciación de las MSCs en condrocitos, ésta no afecta a sus propiedades inmunomoduladoras, pero puede favorecer el desarrollo de mecanismos de memoria inmunológica. Además, en receptores incompatibles para el MHC, las MSCs desarrollan un perfil más inmunogénico, lo que se relaciona con una mayor respuesta inmunitaria local y una mayor producción de aloanticuerpos después de una segunda administración.
Además, la administración repetida de MSC-SE en caballos incompatibles para el MHC mostró una mayor respuesta inmunitaria local y humoral en comparación con la administración de MSCs compatibles, lo que estaría relacionado con un perfil más inmunogénico y menos inmunomodulador de dichas MSCs.
Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral muestran la relevancia de la compatibilidad del MHC entre el donante y el receptor, y contribuyen a una mejor comprensión del efecto de la inflamación y la diferenciación en el equilibrio inmunomodulación - inmunogenicidad de las MSCs equinas. El conocimiento y control de estos factores constituyen potenciales herramientas para lograr terapias celulares alogénicas efectivas y seguras.
Abstract (other lang.):
El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral fue estudiar cómo la inflamación y la diferenciación condrogénica afectan al equilibrio entre la capacidad inmunomoduladora e inmunogénica de las MSCs equinas, teniendo en cuenta la influencia de la compatibilidad para el MHC entre donante y receptor y eligiendo la especie equina por su importancia como paciente y como modelo animal. Para ello, se valoró la respuesta inmune frente a las MSCs tanto a nivel celular y humoral como local y sistémico, utilizando ensayos in vitro e in vivo, para caracterizar de forma completa dicha respuesta.
En primer lugar, se revisó el estado actual, las aplicaciones y las limitaciones de la utilización de las MSCs equinas en diferentes patologías y su potencial traslación como modelo animal para el estudio de diferentes enfermedades en la especie humana, entre las que destacan la uveítis recurrente, las afecciones fibroproliferativas de la piel y el asma.
En los ensayos in vitro llevados a cabo en la presente Tesis Doctoral se analizó la capacidad inmunomoduladora e inmunogénica de las MSCs equinas sin estimular (MSC-SE), estimuladas con citoquinas proinflamatorias (MSC-E) y diferenciadas a condrocito (MSC-C) al exponerlas in vitro a linfocitos de sangre periférica (PBL) autólogos, alogénicos MHC-compatibles y MHC-incompatibles. La estimulación de las MSCs activó su potencial regulador, reduciendo la proliferación de linfocitos T citotóxicos, T colaboradores y linfocitos B. Sin embargo, las MSC-E, especialmente en condiciones de incompatibilidad, mostraron una activación moderada del perfil inmunogénico y estimularon la proliferación de las células T citotóxicas y colaboradoras, aunque estos resultados fueron acompañados de una mayor activación de su perfil regulador. Tras la diferenciación condrogénica, las MSC-C equinas no perdieron su capacidad reguladora ni aumentaron su inmunogenicidad, aunque estimularon la proliferación de linfocitos B y mostraron una capacidad reducida para estimular los linfocitos T reguladores.
En el estudio in vivo, se administraron MSC-SE, MSC-E y MSC-C de forma autóloga, y en receptores MHC-compatibles y MHC-incompatibles. Las MSCs fueron encapsuladas en hidrogeles de alginato y se colocaron tres implantes subcutáneos con el mismo tipo de MSCs en las tablas del cuello de cada receptor. Los implantes se recuperaron a las 1, 3 y 6 semanas de su implantación para su análisis. Transcurrido un mes tras retirar el último de los implantes, se expuso nuevamente a cada animal al mismo tipo de MSCs en las tablas contralaterales del cuello para valorar el efecto de una segunda administración.
El análisis del perfil inmune de las MSCs recuperadas mostró que las MSC-C, tras ser administradas tanto en caballos MHC-compatibles como MHC-incompatibles, conservaban sus propiedades inmunomoduladoras a lo largo del tiempo. Además, la compatibilidad del MHC atenuó la respuesta inmune local inducida tras la administración, especialmente en las MSC-C y MSC-SE. Sin embargo, las MSC-SE administradas en caballos MHC-incompatibles mostraron un perfil inmunogénico más pronunciado y un menor perfil inmunomodulador, junto con una mayor respuesta inmunitaria local en comparación con el grupo MHC-compatible después de ambas administraciones. La administración de MSC-E indujo un reclutamiento local, temprano y pronunciado, de linfocitos, acompañado de una disminución en la expresión de genes relacionados con la inmunomodulación y un aumento de la expresión de genes relacionados con la inmunogenicidad.
La respuesta inmune celular sistémica y la generación de respuesta celular de memoria se evaluó reexponiendo in vitro los PBLs de los distintos receptores al tipo de MSCs que habían recibido de sus correspondientes donantes. Todos los tipos de MSCs MHC-incompatibles indujeron la proliferación de linfocitos T, pero este efecto fue más pronunciado y sostenido en el tiempo en las MSC-E, así como en las MSC-SE después de la segunda administración. Sin embargo, en situación MHC-incompatible, las MSC-E tuvieron menor efecto sobre los linfocitos B a lo largo del tiempo, siendo estos activados en mayor medida tanto por las MSC-C como por las MSC-SE.
En la valoración de la respuesta inmune humoral, los receptores autólogos y MHC-compatibles no desarrollaron anticuerpos contra el MHC del donante de MSCs, independientemente de tipo de MSCs que recibieron. Sin embargo, los caballos MHC-incompatibles desarrollaron aloanticuerpos después de la primera administración y su producción aumentó tras la segunda administración de las mismas MSCs. Aunque los tres tipos de MSCs indujeron el desarrollo de una respuesta inmune humoral en los receptores MHC-incompatibles, las MSC-C produjeron mayores niveles de aloanticuerpos, lo que podría relacionarse con la mayor activación de las células B mencionada anteriormente.
En conclusión, la exposición de las MSCs a citoquinas proinflamatorias activa el perfil inmunomodulador de las MSCs in vitro, aunque dicho perfil no se conserva in vivo. En cambio, prevalece un perfil inmunogénico que afecta negativamente a la capacidad inmunoevasiva de las MSC-E, sobre todo en condiciones de incompatibilidad para el MHC, lo que puede limitar su uso terapéutico.
En cuanto a la diferenciación de las MSCs en condrocitos, ésta no afecta a sus propiedades inmunomoduladoras, pero puede favorecer el desarrollo de mecanismos de memoria inmunológica. Además, en receptores incompatibles para el MHC, las MSCs desarrollan un perfil más inmunogénico, lo que se relaciona con una mayor respuesta inmunitaria local y una mayor producción de aloanticuerpos después de una segunda administración.
Además, la administración repetida de MSC-SE en caballos incompatibles para el MHC mostró una mayor respuesta inmunitaria local y humoral en comparación con la administración de MSCs compatibles, lo que estaría relacionado con un perfil más inmunogénico y menos inmunomodulador de dichas MSCs.
Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral muestran la relevancia de la compatibilidad del MHC entre el donante y el receptor, y contribuyen a una mejor comprensión del efecto de la inflamación y la diferenciación en el equilibrio inmunomodulación - inmunogenicidad de las MSCs equinas. El conocimiento y control de estos factores constituyen potenciales herramientas para lograr terapias celulares alogénicas efectivas y seguras.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: patologia veterinaria
Titulación: Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas
Plan(es): Plan 495
Knowledge area: Ciencias de la Salud
Nota: Presentado: 12 01 2024
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2024
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Fecha de embargo : 2025-01-11
Permalink:
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Record created 2024-05-27, last modified 2024-05-27
