Tobajas De La Fuente, Ana Pilar
Pérez Cabrejas, María Dolores (dir.) ; Sánchez Paniagua, María Lourdes (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Abstract: Las frutas son un alimento esencial en nuestra dieta dado su elevado contenido en vitaminas, fibra y antioxidantes. Sin embargo, son también la causa más frecuente de alergias alimentarias en la población española (44,7 % del total), siendo las rosáceas las causantes del 59% de las alergias a frutas, entre ellas el melocotón (Prunus persica) y la manzana (Malus domestica). Las proteínas Pru p 3 y la Mal d 3 son las más alergénicas del melocotón y de la manzana, respectivamente. Estas proteínas se caracterizan por presentar una alta estabilidad frente a los tratamientos tecnológicos y a la degradación por las proteasas digestivas, siendo las principales causantes de reacciones sistémicas graves que cursan a menudo con shock anafiláctico.
El objetivo principal de este proyecto ha sido investigar la potencial modificación de la estructura de las proteínas Pru p 3 y Mal d 3 utilizando tecnologías de procesado que puedan ser utilizadas a nivel industrial para reducir la alergenicidad de los productos derivados de las mismas. Así mismo, se ha estudiado cómo afecta la variedad de manzana, el grado de madurez y las condiciones de almacenamiento en el contenido en Mal d 3.
Para realizar este estudio, se han desarrollado técnicas de ELISA sandwich para determinar las proteínas Pru p 3 y Mal d 3, para lo que fue necesario previamente purificar las proteínas, obtener anticuerpos específicos frente a ellas, y conjugarlos con un enzima marcador. El grado de desnaturalización de Pru p 3 y Mal d 3 por efecto de los tratamientos tecnológicos (térmicos, pulsos eléctricos de alto voltaje, altas presiones hidrostáticas, ultrasonidos y proteolisis) se determinó midiendo la pérdida de inmunorreactividad (antigenicidad) utilizando las técnicas desarrolladas. El efecto de los tratamientos tecnológicos en la alergenicidad de la Pru p 3 y Mal d 3 se determinó ¿in vitro¿, mediante una técnica de inmunofluorescencia de tipo competitivo utilizando pools de sueros o sueros individuales de pacientes alérgicos a melocotón o manzana, y mediante la prueba ¿in vivo¿ de prick test.
Para la caracterización del grado de madurez de las manzanas, se determinó la firmeza, contenido en sólidos solubles totales y acidez titulable. Además, en la piel de las manzanas se determinó el contenido en proteína total, el perfil proteico y el contenido en Mal d 3.
Los resultados obtenidos con los tratamientos térmicos mostraron que la Pru p 3 tratada en extracto de melocotón es estable a 75 ºC y 85 ºC durante 40 min. Sin embargo, a 95 ºC, el grado de desnaturalización aumentó con el tiempo de tratamiento, obteniéndose valores de inmunorreactividad de un 30% y 60% inferiores respecto al control a los 20 y 40 min, respectivamente. Cuando la proteína se trató en tampón, la desnaturalización fue mayor, lo que sugiere un efecto protector de los componentes del extracto.
El tratamiento con pulsos eléctricos de alto voltaje a 25,5 kV/cm y 25ºC no tuvo efecto en la Pru p 3, mientras que, al combinarlo con calor, la desnaturalización a 50ºC fue de un 54%.
El tratamiento de altas presiones del extracto de piel de melocotón a 20 ºC indujo cambios en la proteína Pru p 3 a presiones superiores a 500 MPa. El tratamiento combinado con calor a 50 ºC resultó en un mayor grado de desnaturalización, disminuyendo la proteína inmunorreactiva más del 40% a 400 MPa, y manteniéndose prácticamente en ese nivel al aplicar presiones mayores.
Los tratamientos de ultrasonidos indujeron cambios en la desnaturalización de la Pru p 3, cuya magnitud dependió de la amplitud aplicada. El tratamiento de ultrasonidos combinado con presión (manosonicación) produjo una mayor pérdida de inmunorreactividad, que fue de un 43% tras el tratamiento más severo de 100 µm y 100 kPa.
Los resultados del efecto de los tratamientos tecnológicos aplicados en este estudio en la alergenicidad de la Pru p 3 mostraron que independientemente de la tecnología aplicada y las condiciones utilizadas, no son capaces de disminuir más allá de un 10% la reactividad de la proteína con las IgE de sueros de pacientes alérgicos.
Cuando las muestras de Pru p 3 tratadas con pulsos eléctricos y altas presiones en las condiciones más severas se ensayaron en pacientes alérgicos, se observó una respuesta muy variable, con un aumento o una disminución del tamaño del habón en aproximadamente el 40-45% de los pacientes, lo que sugiere una respuesta individual que depende de la afectación por los tratamientos de los epítopos frente a los que está sensibilizado cada paciente.
Por otra parte, la Pru p 3 ha mostrado tener una alta resistencia frente a los tratamientos de proteólisis en los que se han ensayado 20 proteasas, ya que sólo es degradada eficientemente por la proteasa de páncreas bovino y las proteasas ácidas 1 y 2, siendo éstas últimas las que al poseer un pH óptimo ácido, se podrían aplicar en el procesado de las frutas. Los hidrolizados obtenidos con estas proteasas ácidas no contienen proteína nativa y los péptidos obtenidos son menores de 3,2 y 1,8 kDa para los tratamientos realizados a 50ºC/2h y 25ºC/24h, respectivamente. Estos hidrolizados mostraron un marcado efecto en reducir la reactividad de la Pru p 3 con las IgE del suero de alérgicos, entre un 65 y un 85% de los individuos. Así mismo, esos hidrolizados mostraron una disminución del tamaño del habón en la prueba de prick test en más del 90% de los pacientes alérgicos, con un tamaño medio del diámetro del habón entre un 70 y un 85% menor al de la proteína sin tratar. Los resultados obtenidos con Mal 3 en el estudio de proteólisis han sido similares a los obtenidos con Pru p 3 y sugieren que la utilización de las proteasas ácidas 1 o 2 en el procesado permitiría obtener productos de frutas rosáceas menos alergénicos y, por tanto, más tolerables para la población sensible.
Por otra parte, el estudio llevado a cabo para determinar la cantidad de Mal d 3 en diferentes variedades de manzana mostró un rango de concentraciones de entre 13¿6 ± 3¿0 µg/g (Golden) y 25¿2 ± 3¿9 µg/g (Verde Doncella) en el grado óptimo de madurez. El grado de madurez no parece tener una influencia significativa en el contenido en Mal d 3, mientras que durante el almacenamiento en atmósfera controlada se produce una disminución de la proteína entre 1¿3 y 2¿5 veces.
Abstract (other lang.):
El objetivo principal de este proyecto ha sido investigar la potencial modificación de la estructura de las proteínas Pru p 3 y Mal d 3 utilizando tecnologías de procesado que puedan ser utilizadas a nivel industrial para reducir la alergenicidad de los productos derivados de las mismas. Así mismo, se ha estudiado cómo afecta la variedad de manzana, el grado de madurez y las condiciones de almacenamiento en el contenido en Mal d 3.
Para realizar este estudio, se han desarrollado técnicas de ELISA sandwich para determinar las proteínas Pru p 3 y Mal d 3, para lo que fue necesario previamente purificar las proteínas, obtener anticuerpos específicos frente a ellas, y conjugarlos con un enzima marcador. El grado de desnaturalización de Pru p 3 y Mal d 3 por efecto de los tratamientos tecnológicos (térmicos, pulsos eléctricos de alto voltaje, altas presiones hidrostáticas, ultrasonidos y proteolisis) se determinó midiendo la pérdida de inmunorreactividad (antigenicidad) utilizando las técnicas desarrolladas. El efecto de los tratamientos tecnológicos en la alergenicidad de la Pru p 3 y Mal d 3 se determinó ¿in vitro¿, mediante una técnica de inmunofluorescencia de tipo competitivo utilizando pools de sueros o sueros individuales de pacientes alérgicos a melocotón o manzana, y mediante la prueba ¿in vivo¿ de prick test.
Para la caracterización del grado de madurez de las manzanas, se determinó la firmeza, contenido en sólidos solubles totales y acidez titulable. Además, en la piel de las manzanas se determinó el contenido en proteína total, el perfil proteico y el contenido en Mal d 3.
Los resultados obtenidos con los tratamientos térmicos mostraron que la Pru p 3 tratada en extracto de melocotón es estable a 75 ºC y 85 ºC durante 40 min. Sin embargo, a 95 ºC, el grado de desnaturalización aumentó con el tiempo de tratamiento, obteniéndose valores de inmunorreactividad de un 30% y 60% inferiores respecto al control a los 20 y 40 min, respectivamente. Cuando la proteína se trató en tampón, la desnaturalización fue mayor, lo que sugiere un efecto protector de los componentes del extracto.
El tratamiento con pulsos eléctricos de alto voltaje a 25,5 kV/cm y 25ºC no tuvo efecto en la Pru p 3, mientras que, al combinarlo con calor, la desnaturalización a 50ºC fue de un 54%.
El tratamiento de altas presiones del extracto de piel de melocotón a 20 ºC indujo cambios en la proteína Pru p 3 a presiones superiores a 500 MPa. El tratamiento combinado con calor a 50 ºC resultó en un mayor grado de desnaturalización, disminuyendo la proteína inmunorreactiva más del 40% a 400 MPa, y manteniéndose prácticamente en ese nivel al aplicar presiones mayores.
Los tratamientos de ultrasonidos indujeron cambios en la desnaturalización de la Pru p 3, cuya magnitud dependió de la amplitud aplicada. El tratamiento de ultrasonidos combinado con presión (manosonicación) produjo una mayor pérdida de inmunorreactividad, que fue de un 43% tras el tratamiento más severo de 100 µm y 100 kPa.
Los resultados del efecto de los tratamientos tecnológicos aplicados en este estudio en la alergenicidad de la Pru p 3 mostraron que independientemente de la tecnología aplicada y las condiciones utilizadas, no son capaces de disminuir más allá de un 10% la reactividad de la proteína con las IgE de sueros de pacientes alérgicos.
Cuando las muestras de Pru p 3 tratadas con pulsos eléctricos y altas presiones en las condiciones más severas se ensayaron en pacientes alérgicos, se observó una respuesta muy variable, con un aumento o una disminución del tamaño del habón en aproximadamente el 40-45% de los pacientes, lo que sugiere una respuesta individual que depende de la afectación por los tratamientos de los epítopos frente a los que está sensibilizado cada paciente.
Por otra parte, la Pru p 3 ha mostrado tener una alta resistencia frente a los tratamientos de proteólisis en los que se han ensayado 20 proteasas, ya que sólo es degradada eficientemente por la proteasa de páncreas bovino y las proteasas ácidas 1 y 2, siendo éstas últimas las que al poseer un pH óptimo ácido, se podrían aplicar en el procesado de las frutas. Los hidrolizados obtenidos con estas proteasas ácidas no contienen proteína nativa y los péptidos obtenidos son menores de 3,2 y 1,8 kDa para los tratamientos realizados a 50ºC/2h y 25ºC/24h, respectivamente. Estos hidrolizados mostraron un marcado efecto en reducir la reactividad de la Pru p 3 con las IgE del suero de alérgicos, entre un 65 y un 85% de los individuos. Así mismo, esos hidrolizados mostraron una disminución del tamaño del habón en la prueba de prick test en más del 90% de los pacientes alérgicos, con un tamaño medio del diámetro del habón entre un 70 y un 85% menor al de la proteína sin tratar. Los resultados obtenidos con Mal 3 en el estudio de proteólisis han sido similares a los obtenidos con Pru p 3 y sugieren que la utilización de las proteasas ácidas 1 o 2 en el procesado permitiría obtener productos de frutas rosáceas menos alergénicos y, por tanto, más tolerables para la población sensible.
Por otra parte, el estudio llevado a cabo para determinar la cantidad de Mal d 3 en diferentes variedades de manzana mostró un rango de concentraciones de entre 13¿6 ± 3¿0 µg/g (Golden) y 25¿2 ± 3¿9 µg/g (Verde Doncella) en el grado óptimo de madurez. El grado de madurez no parece tener una influencia significativa en el contenido en Mal d 3, mientras que durante el almacenamiento en atmósfera controlada se produce una disminución de la proteína entre 1¿3 y 2¿5 veces.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: alergias ; inmunoquímica ; proteínas ; tecnología de los alimentos
Titulación: Programa de Doctorado en Calidad, Seguridad y Tecnología de los Alimentos
Plan(es): Plan 486
Knowledge area: Ciencias
Nota: Presentado: 20 01 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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