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Síntesis y caracterización de la variante de la Apolipoproteína A-I (APO A-I Zaragoza) y análisis de posibilidades de uso farmacológico

Fiddyment Puertas, Sarah
García Otín, Angel Luis (dir.) ; Pocovi Mieras, Miguel (dir.)

Universidad de Zaragoza, 2011

ISBN: 9788469499061, 9788469499061

Abstract: La apolipoproteína A-I Zaragoza (apo A-I Z, mutación L144R) es una variante de la apolipoproteína A-I cuyos portadores tienen muy baja concentración de colesterol-HDL (c-HDL) pero, aunque presenten factores de riesgo aterogénicos adicionales, paradójicamente no muestran signos de aterosclerosis a nivel subclínico. Estudios metabólicos in vivo realizados previamente en portadores heterocigotos de esta variante de apo A-I revelaron que tiene una tasa de catabolismo que duplica la de la proteína nativa sugiriendo la posibilidad de que tuviera un efecto favorable sobre el proceso global de transporte reverso de colesterol. El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de expresión y purificación de apo A-I nativa y apo A-I Z recombinantes de alto rendimiento y elevada pureza con el fin de comparar in vitro sus propiedades en distintos aspectos relativos al transporte reverso de colesterol, así como otras características antiaterogénicas de la apo A-I. Se han optimizado la expresión y el método de purificación de la apo A-I nativa y apo A-I Z además de producir partículas reconstituidas similares a la HDL (rHDL) para poder realizar una caracterización estructural y funcional. La caracterización estructural incluyó análisis mediante espectrometría de masas, estudios de tamaño y estructura mediante FPLC y electroforesis en geles no desnaturalizantes, microscopía electrónica de transmisión para analizar las partículas reconstituidas y estudio de la estabilidad proteica mediante desnaturalización térmica. Los resultados de las distintas técnicas sugieren la existencia de diferencias a nivel estructural. La apo A-I Z parece adoptar una conformación más abierta tanto en forma de proteína libre como en partículas rHDL. Asimismo el patrón de desnaturalización térmica indica que la apo A-I Z sería menos estable que la forma nativa. La caracterización funcional consistía en el estudio del proceso de eflujo de colesterol desde macrófagos, utilizando un marcaje radiactivo, y en el estudio de la captación de colesterol por parte de una línea celular hepática a través de microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. El análisis de la variante apo A-I Zaragoza mostró una mayor eficacia en la cesión de colesterol a células hepáticas y un ligero aumento en el eflujo de colesterol desde macrófagos, lo cual contribuiría a explicar parcialmente sus propiedades ateroprotectoras.

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