Lapieza Remón, Mª Pilar
Cebolla Burillo, Vicente Luis (dir.) ; Sanz Vicente, Isabel (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2018
Resumen: La Lipidómica hace referencia a la disciplina de investigación basada en el análisis de las especies lipídicas, e incluye la identificación y cuantificación de los miles de especies moleculares de lípidos celulares en sistemas biológicos.
Los avances en tecnología analítica, especialmente en Espectrometría de Masas (MS) han impulsado la investigación en Lipidómica y la del análisis de lípidos en matrices de interés industrial relacionadas con la alimentación y la bioenergía.
Aunque la plataforma más utilizada es sin duda el acoplamiento con la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Columna, con ionización de tipo electrospray, LC-MS (ESI), no hay un único esquema basado en MS que pueda cubrir la detección del lipidoma completo, debido a la diversidad de las estructuras moleculares existentes.
En esta Tesis se ha evaluado la aportación de dos técnicas y se han desarrollado nuevas metodologías analíticas para el análisis de diferentes clases de lípidos en muestras complejas que proceden de matrices diferentes utilizando dos enfoques distintos.
Por un lado, para el análisis de las especies moleculares individuales de diferentes clases de esfingolípidos (SL) en plasma humano, lípidos neutros (LN) y ácidos grasos (FA) en biodiésel, y fosfolípidos (PL) en extractos de membranas bacterianas y su complejo purificado, se ha llevado a cabo el desarrollo de la técnica de Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia acoplada a técnicas tándem MS (HPTLC-MSn) y de alta resolución HRMS.
Desde una misma placa cromatográfica se obtiene:
• una separación en clases de lípidos
• perfiles semicuantitativos dentro de cada clase de lípidos por ESI-MS
• determinación estructural inequívoca y directa de los lípidos individuales y sus especies moleculares por tamden MS/HRMS
Se demuestra que esta técnica tiene especial interés en la caracterización rápida de bandas diana en la zona deseada de la placa. La selectividad espacial proporcionada por la técnica la hace complementaria a LC-MS. Otras ventajas son alta capacidad de tratamiento de un elevado número de muestras simultáneamente, desarrollo paralelo de muestras y patrones y bajo coste relativo en tiempo y disolvente.
Tradicionalmente el enfoque MS/MS no se había desarrollado en HPTLC debido a que la formación conjunta de especies sodiadas y protonadas complicaba la interpretación de los espectros. Los aductos de sodio de los espectros ESI-MS pueden ser fragmentados en modo ESI+ usando tecnologías de trampa de iones y cuadrupolo TOF. El sodio permanece como carga de los iones producto siendo este hecho útil para la identificación de las estructuras de los lípidos. Los espectros se obtienen de manera rápida, fiable y sencilla a partir de las bandas separadas en la placa mostrando buena intensidad y calidad.
Por otro lado, buscando selectividad hacia un único analito se ha desarrollado una metodología analítica basada en la fluorescencia de las flavoenzimas, que permite la determinación de fosfolípidos que contienen colina, como la fosfatidilcolina (PC).
Si sobre ella actúa la lipasa (PLC) se obtiene fosforilcolina (ChoP) que a su vez reacciona con la enzima fosfatasa alcalina (AP) obteniendo colina (Ch).
PLC AP ChOx
PC-------->ChoP--------->Ch--------->betaina+H2O2
La enzima colina oxidasa (ChOx) es una flavoenzima que cambia sus propiedades ópticas durante su reacción con Ch, hecho que se puede utilizar para la determinación de PC o sus metabolitos sin la necesidad de añadir más reactivos que los involucrados en la reacción.
En esta tesis esta metodología se aplica a la determinación de ChoP y Ch en muestras de leche infantil poniendo de manifiesto las posibilidades de la técnica:
• dependiendo del interés se puede hacer la determinación secuencial o simultánea simplemente cambiando el orden de adición de los reactivos
• puesto que la selectividad la aportan las reacciones enzimáticas el tratamiento de muestra es corto y sencillo.
• la metodología se ha desarrollado en un lector de placas de pocillos por lo que es muy económico
• las interferencias espectrales se evitan de forma sencilla modificando químicamente la enzima para trabajar a longitudes de onda adecuadas.
• puesto que las enzimas se regeneran se pueden desarrollar sensores, para lo que se deben inmovilizar en los soportes adecuados. Se eligió un soporte basado en gel de acrilamida pudiéndose desarrollar un sensor tanto para colina como para fosfato de colina.
Resumen (otro idioma):
Los avances en tecnología analítica, especialmente en Espectrometría de Masas (MS) han impulsado la investigación en Lipidómica y la del análisis de lípidos en matrices de interés industrial relacionadas con la alimentación y la bioenergía.
Aunque la plataforma más utilizada es sin duda el acoplamiento con la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Columna, con ionización de tipo electrospray, LC-MS (ESI), no hay un único esquema basado en MS que pueda cubrir la detección del lipidoma completo, debido a la diversidad de las estructuras moleculares existentes.
En esta Tesis se ha evaluado la aportación de dos técnicas y se han desarrollado nuevas metodologías analíticas para el análisis de diferentes clases de lípidos en muestras complejas que proceden de matrices diferentes utilizando dos enfoques distintos.
Por un lado, para el análisis de las especies moleculares individuales de diferentes clases de esfingolípidos (SL) en plasma humano, lípidos neutros (LN) y ácidos grasos (FA) en biodiésel, y fosfolípidos (PL) en extractos de membranas bacterianas y su complejo purificado, se ha llevado a cabo el desarrollo de la técnica de Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia acoplada a técnicas tándem MS (HPTLC-MSn) y de alta resolución HRMS.
Desde una misma placa cromatográfica se obtiene:
• una separación en clases de lípidos
• perfiles semicuantitativos dentro de cada clase de lípidos por ESI-MS
• determinación estructural inequívoca y directa de los lípidos individuales y sus especies moleculares por tamden MS/HRMS
Se demuestra que esta técnica tiene especial interés en la caracterización rápida de bandas diana en la zona deseada de la placa. La selectividad espacial proporcionada por la técnica la hace complementaria a LC-MS. Otras ventajas son alta capacidad de tratamiento de un elevado número de muestras simultáneamente, desarrollo paralelo de muestras y patrones y bajo coste relativo en tiempo y disolvente.
Tradicionalmente el enfoque MS/MS no se había desarrollado en HPTLC debido a que la formación conjunta de especies sodiadas y protonadas complicaba la interpretación de los espectros. Los aductos de sodio de los espectros ESI-MS pueden ser fragmentados en modo ESI+ usando tecnologías de trampa de iones y cuadrupolo TOF. El sodio permanece como carga de los iones producto siendo este hecho útil para la identificación de las estructuras de los lípidos. Los espectros se obtienen de manera rápida, fiable y sencilla a partir de las bandas separadas en la placa mostrando buena intensidad y calidad.
Por otro lado, buscando selectividad hacia un único analito se ha desarrollado una metodología analítica basada en la fluorescencia de las flavoenzimas, que permite la determinación de fosfolípidos que contienen colina, como la fosfatidilcolina (PC).
Si sobre ella actúa la lipasa (PLC) se obtiene fosforilcolina (ChoP) que a su vez reacciona con la enzima fosfatasa alcalina (AP) obteniendo colina (Ch).
PLC AP ChOx
PC-------->ChoP--------->Ch--------->betaina+H2O2
La enzima colina oxidasa (ChOx) es una flavoenzima que cambia sus propiedades ópticas durante su reacción con Ch, hecho que se puede utilizar para la determinación de PC o sus metabolitos sin la necesidad de añadir más reactivos que los involucrados en la reacción.
En esta tesis esta metodología se aplica a la determinación de ChoP y Ch en muestras de leche infantil poniendo de manifiesto las posibilidades de la técnica:
• dependiendo del interés se puede hacer la determinación secuencial o simultánea simplemente cambiando el orden de adición de los reactivos
• puesto que la selectividad la aportan las reacciones enzimáticas el tratamiento de muestra es corto y sencillo.
• la metodología se ha desarrollado en un lector de placas de pocillos por lo que es muy económico
• las interferencias espectrales se evitan de forma sencilla modificando químicamente la enzima para trabajar a longitudes de onda adecuadas.
• puesto que las enzimas se regeneran se pueden desarrollar sensores, para lo que se deben inmovilizar en los soportes adecuados. Se eligió un soporte basado en gel de acrilamida pudiéndose desarrollar un sensor tanto para colina como para fosfato de colina.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: quimica analitica ; lipidos
Titulación: Programa de Doctorado en Ciencia Analítica en Química
Plan(es): Plan 487
Departamento: Química Analítica
Nota: Presentado: 30 05 2018
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Química Analítica, 2018
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Registro creado el 2020-06-26, última modificación el 2021-05-20
