Valledor Martín, Silvia
Tomás Mateo, Elena De (dir.) ; Gómez-Moreno Calera, Carlos (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2021
Abstract: La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se ha convertido en una de las
técnicas de elección en el diagnóstico clínico por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Esta
técnica se ha implementado como reemplazo o apoyo a las técnicas de diagnóstico
convencionales, ya que su rapidez y fiabilidad permiten, además de identificar al agente
etiológico de la enfermedad, orientar el tratamiento del paciente, contener la infección y frenar
los contagios. Recientemente, su papel en el control de la pandemia por el Coronavirus de tipo
2 causante del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2) ha sido crucial para llevar a
cabo un buen control epidemiológico. Además, esta técnica permite cuantificar el número de
copias de un gen diana en particular, lo que resulta muy valioso como indicador de la evolución
de un paciente a un determinado tratamiento.
El incremento de la disponibilidad de ensayos qPCR debe ir asociado a una mayor disponibilidad
de materiales de referencia, esto es, controles del proceso que permitan validar la técnica y
detectar posibles resultados falsos positivos o negativos, los cuales podrían tener un impacto
desfavorable en la salud del paciente y en el control de la enfermedad. Por otra parte, estos
controles son necesarios para comparar la sensibilidad y especificidad entre diferentes ensayos
qPCR, interpretar los resultados de los análisis inter- e intra-laboratorio o llevar a cabo estudios
de validación de ensayos qPCR cumpliendo la normativa vigente. Sin embargo, a pesar de su
relevancia, la disponibilidad de controles del proceso para ensayos qPCR es limitada, ya sea por
la escasa disponibilidad de muestras clínicas, en el caso de patógenos emergentes, exóticos y/o
endémicos, la dificultad técnica de su cultivo o la necesidad de instalaciones de alto nivel de
bioseguridad para su manipulación.
Un control de proceso debe cumplir idealmente los siguientes requisitos: monitorizar todas las
etapas del proceso, presentar una estructura similar a la muestra testada, ser no infeccioso,
reproducible, estable en el tiempo y aplicable a una amplia gama de ensayos.
Existen en el mercado diferentes tipos de controles, en su mayoría consistentes en secuencias
sintéticas de DNA, plásmidos que contienen el DNA de interés o secuencias de RNA obtenidas
por transcripción in vitro. Estos controles permiten monitorizar la reacción de qPCR, pero no
monitorizan con fidelidad el paso previo de extracción de ácidos nucleicos, ya que no imitan al
patógeno que se desea identificar, carecen de estructura externa y son susceptibles a la
degradación por nucleasas; y, en el caso de las secuencias sintéticas de DNA o DNA plasmídico,
tampoco se monitoriza la etapa previa de retrotranscripción. Por otra parte, se comercializan
cepas de diferentes bacterias, virus o parásitos que son aislados de pacientes con infección y
permiten la monitorización completa del proceso de qPCR (incluyendo la extracción de ácidos
nucleicos), pero, en algunos casos, su manipulación requiere medidas y contención propia de un
nivel de bioseguridad 3 o superior, por lo que se precisa de instalaciones muy concretas y
personal experimentado.
En este proyecto de investigación se propone una estrategia, basada en la transfección de
células eucariotas con plásmidos lentivirales, para la generación in vitro de partículas virales
recombinantes, no infecciosas y de genoma RNA, dando respuesta a las limitaciones
anteriormente comentadas. Los vectores lentivirales están ampliamente extendidos en el
campo de la terapia génica, en virología o en el desarrollo de vacunas, sin embargo, su aplicación
para la generación de controles de proceso de los ensayos de qPCR es novedosa.
Esta tecnología explota la capacidad que poseen los virus de empaquetar un ácido nucleico
exógeno, siempre que su tamaño no exceda el límite del sistema y su secuencia contenga unas mínimas señales de empaquetamiento. Se trata de un sistema muy versátil, mediante el cual es
posible crear infinidad de controles, cuya estructura externa sea común a todos ellos
(correspondiente a lentivirus) y el genoma empaquetado variable, en función del control de
proceso diseñado.
En el presente proyecto, para la generación in vitro de partículas virales recombinantes de
genoma RNA ha sido necesario, en primer lugar, la confección de una colección de plásmidos
que contengan fragmentos del genoma o el genoma completo de los virus de interés. En
segundo lugar, la puesta a punto de un protocolo de generación de partículas virales y,
finalmente, la purificación de las partículas virales, su cuantificación por PCR digital y su
estabilización mediante liofilización. Las partículas virales desarrolladas se han validado para su
uso como control positivo de ensayos de RT-qPCR, evaluando su funcionalidad tras ser
procesadas por diferentes sistemas de extracción de ácidos nucleicos y diferentes ensayos de
PCR en tiempo real, así como su reproducibilidad y repetibilidad. También se han realizado
diferentes ensayos orientados a determinar la vida útil del producto y su estabilidad en
diferentes condiciones. Por último, se ha evaluado su capacidad infectiva y se ha verificado,
mediante secuenciación masiva, la secuencia del RNA contenido en las partículas virales.
Los resultados obtenidos indican que las partículas virales sintetizadas en este proyecto:
¿ Son partículas virales no infecciosas y defectivas para la replicación. Todas las partículas
virales creadas mediante este sistema pueden ser manipuladas en nivel de bioseguridad
tipo 2.
¿ Son un control fiable del proceso de extracción de ácidos nucleicos, ya que mimetizan
la estructura de un virus salvaje, por lo que se consigue una monitorización completa
del proceso, desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la amplificación por qPCR,
incluyendo la etapa previa de retrotranscripción.
¿ Se trata de un producto reproducible y estable en el tiempo. Se presenta en formato
liofilizado, por lo que se puede transportar y almacenar a temperatura ambiente, y
presenta una vida útil de dos años.
¿ De uso universal. Son compatibles con cualquier sistema optimizado de extracción de
ácidos nucleicos y PCR en tiempo real y accesibles a cualquier laboratorio, sin necesidad
de instalaciones y medidas de contención propias de un nivel de bioseguridad elevado.
Abstract (other lang.):
técnicas de elección en el diagnóstico clínico por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Esta
técnica se ha implementado como reemplazo o apoyo a las técnicas de diagnóstico
convencionales, ya que su rapidez y fiabilidad permiten, además de identificar al agente
etiológico de la enfermedad, orientar el tratamiento del paciente, contener la infección y frenar
los contagios. Recientemente, su papel en el control de la pandemia por el Coronavirus de tipo
2 causante del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2) ha sido crucial para llevar a
cabo un buen control epidemiológico. Además, esta técnica permite cuantificar el número de
copias de un gen diana en particular, lo que resulta muy valioso como indicador de la evolución
de un paciente a un determinado tratamiento.
El incremento de la disponibilidad de ensayos qPCR debe ir asociado a una mayor disponibilidad
de materiales de referencia, esto es, controles del proceso que permitan validar la técnica y
detectar posibles resultados falsos positivos o negativos, los cuales podrían tener un impacto
desfavorable en la salud del paciente y en el control de la enfermedad. Por otra parte, estos
controles son necesarios para comparar la sensibilidad y especificidad entre diferentes ensayos
qPCR, interpretar los resultados de los análisis inter- e intra-laboratorio o llevar a cabo estudios
de validación de ensayos qPCR cumpliendo la normativa vigente. Sin embargo, a pesar de su
relevancia, la disponibilidad de controles del proceso para ensayos qPCR es limitada, ya sea por
la escasa disponibilidad de muestras clínicas, en el caso de patógenos emergentes, exóticos y/o
endémicos, la dificultad técnica de su cultivo o la necesidad de instalaciones de alto nivel de
bioseguridad para su manipulación.
Un control de proceso debe cumplir idealmente los siguientes requisitos: monitorizar todas las
etapas del proceso, presentar una estructura similar a la muestra testada, ser no infeccioso,
reproducible, estable en el tiempo y aplicable a una amplia gama de ensayos.
Existen en el mercado diferentes tipos de controles, en su mayoría consistentes en secuencias
sintéticas de DNA, plásmidos que contienen el DNA de interés o secuencias de RNA obtenidas
por transcripción in vitro. Estos controles permiten monitorizar la reacción de qPCR, pero no
monitorizan con fidelidad el paso previo de extracción de ácidos nucleicos, ya que no imitan al
patógeno que se desea identificar, carecen de estructura externa y son susceptibles a la
degradación por nucleasas; y, en el caso de las secuencias sintéticas de DNA o DNA plasmídico,
tampoco se monitoriza la etapa previa de retrotranscripción. Por otra parte, se comercializan
cepas de diferentes bacterias, virus o parásitos que son aislados de pacientes con infección y
permiten la monitorización completa del proceso de qPCR (incluyendo la extracción de ácidos
nucleicos), pero, en algunos casos, su manipulación requiere medidas y contención propia de un
nivel de bioseguridad 3 o superior, por lo que se precisa de instalaciones muy concretas y
personal experimentado.
En este proyecto de investigación se propone una estrategia, basada en la transfección de
células eucariotas con plásmidos lentivirales, para la generación in vitro de partículas virales
recombinantes, no infecciosas y de genoma RNA, dando respuesta a las limitaciones
anteriormente comentadas. Los vectores lentivirales están ampliamente extendidos en el
campo de la terapia génica, en virología o en el desarrollo de vacunas, sin embargo, su aplicación
para la generación de controles de proceso de los ensayos de qPCR es novedosa.
Esta tecnología explota la capacidad que poseen los virus de empaquetar un ácido nucleico
exógeno, siempre que su tamaño no exceda el límite del sistema y su secuencia contenga unas mínimas señales de empaquetamiento. Se trata de un sistema muy versátil, mediante el cual es
posible crear infinidad de controles, cuya estructura externa sea común a todos ellos
(correspondiente a lentivirus) y el genoma empaquetado variable, en función del control de
proceso diseñado.
En el presente proyecto, para la generación in vitro de partículas virales recombinantes de
genoma RNA ha sido necesario, en primer lugar, la confección de una colección de plásmidos
que contengan fragmentos del genoma o el genoma completo de los virus de interés. En
segundo lugar, la puesta a punto de un protocolo de generación de partículas virales y,
finalmente, la purificación de las partículas virales, su cuantificación por PCR digital y su
estabilización mediante liofilización. Las partículas virales desarrolladas se han validado para su
uso como control positivo de ensayos de RT-qPCR, evaluando su funcionalidad tras ser
procesadas por diferentes sistemas de extracción de ácidos nucleicos y diferentes ensayos de
PCR en tiempo real, así como su reproducibilidad y repetibilidad. También se han realizado
diferentes ensayos orientados a determinar la vida útil del producto y su estabilidad en
diferentes condiciones. Por último, se ha evaluado su capacidad infectiva y se ha verificado,
mediante secuenciación masiva, la secuencia del RNA contenido en las partículas virales.
Los resultados obtenidos indican que las partículas virales sintetizadas en este proyecto:
¿ Son partículas virales no infecciosas y defectivas para la replicación. Todas las partículas
virales creadas mediante este sistema pueden ser manipuladas en nivel de bioseguridad
tipo 2.
¿ Son un control fiable del proceso de extracción de ácidos nucleicos, ya que mimetizan
la estructura de un virus salvaje, por lo que se consigue una monitorización completa
del proceso, desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la amplificación por qPCR,
incluyendo la etapa previa de retrotranscripción.
¿ Se trata de un producto reproducible y estable en el tiempo. Se presenta en formato
liofilizado, por lo que se puede transportar y almacenar a temperatura ambiente, y
presenta una vida útil de dos años.
¿ De uso universal. Son compatibles con cualquier sistema optimizado de extracción de
ácidos nucleicos y PCR en tiempo real y accesibles a cualquier laboratorio, sin necesidad
de instalaciones y medidas de contención propias de un nivel de bioseguridad elevado.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: biología molecular ; retrovirus ; microbiología ; biotecnología
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Knowledge area: Ciencias
Nota: Presentado: 26 10 2021
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2021
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Record created 2023-11-23, last modified 2023-11-23
