Beltrán Rosel, Antonio
Oteo Revuelta, José Antonio (dir.) ; Benito Ruesca, Rafael (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2023
Resumen: En España, al igual que en otros países del mundo, el espectro de enfermedades transmitidas por garrapatas, así como su incidencia, han aumentado en los últimos años. Ante un paciente con una picadura de garrapata, la identificación a nivel de especie del ejemplar puede ser complicado fuera del ámbito de los centros especializados. En base al hecho de que, las infecciones transmitidas por la picadura de garrapatas muestran una marcada especificidad vectorial, conocer la identidad de la garrapata puede resultar muy útil en la toma de decisiones clínicas, incluyendo, entre otras, la necesidad (o no) de instaurar un tratamiento antibiótico. Los métodos clásicos de identificación consisten en la
inspección visual del espécimen y las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos.
Sin embargo, ninguno de estos métodos está exento de limitaciones en términos de costes, tiempo de entrega de resultados, laboriosidad, necesidad de personal altamente entrenado, etc.
En los últimos años, la espectrometría de masas por desorción-ionización con láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), ha sido aplicada con éxito en la identificación de garrapatas. Sin embargo, el conocimiento acerca del rendimiento de esta tecnología en un contexto clínico (con pacientes reales) es mucho más limitado. Los objetivos del presente estudio fueron, en primer lugar, la optimización de un protocolo de extracción proteica y adquisición de espectros; en segundo lugar, la construcción de una biblioteca de espectros de referencia, suficientemente representativa. Dicha biblioteca fue construida a partir de los espectros adquiridos a partir de muestras de extremidades de garrapatas. Las
especies de garrapatas que fueron incluidas en la biblioteca incluyen aquellas que suelen picar a humanos en España: Dermacentor marginatus, Dermacentor reticulatus, Haemaphysalis punctata, Hyalomma lusitanicum, Hyalomma marginatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa, Rhipicephalus pusillus y Rhipicephalus sanguineus sensu lato. También se incluyeron aquellas especies que, con menor frecuencia, también están involucradas en picaduras a humanos en nuestro país: Haemaphysalis inermis, Haemaphysalis concinna, Hyalomma scupense, Ixodes
frontalis, Ixodes hexagonus y Argas sp. Los especímenes fueron identificados, primero visualmente, y posteriormente mediante PCR y secuenciación de un fragmento del gen ARNr 16S.
La validación del protocolo se ejecutó mediante la realización secuencial de diversos test. En los primeros de estos ensayos de validación, realizados con especímenes recolectados de diversas fuentes, excepto pacientes, se obtuvo una correlación del 100% entre los métodos moleculares y la espectrometría de masas.
En las segundas de estas pruebas, realizadas exclusivamente con garrapatas retiradas de pacientes, se observó una correlación del 92.59 %, y todas las especies estudiadas obtuvieron unas puntuaciones de identificación discretamente inferiores respecto a los resultados obtenidos en los primeros ensayos. Sólo se obtuvo la identificación incorrecta en el caso de dos ninfas de I. ricinus, las cuales fueron identificadas como Ctenocephalides felis (una especie de pulga). Sin embargo, el problema de discriminación entre estas dos especies difícilmente presente
un impacto clínico apreciable, debido a que ambas especies de artrópodos presentan rasgos morfológicos muy diferenciados.
Tras la validación del protocolo, la tecnología MALDI-TOF MS fue incorporada en el Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa como la técnica
de primera elección en la identificación de garrapatas. Tras quince meses de experiencia clínica, los resultados obtenidos permitieron confirmar el excelente rendimiento observado en los ensayos de validación. Un total de 34 ejemplares fueron remitidos al laboratorio para su identificación, de los cuales 33/34 (97,06 %) obtuvieron una identificación correcta. Tan sólo un ejemplar adulto de R. sanguineus s.l. fue incorrectamente identificado como R. pusillus, ambos con un score de identificación prácticamente idénticos (1,93 vs 1,92).
Por tanto, la tecnología MALDI-TOF MS puede ser utilizada como herramienta de identificación de garrapatas, con la rápida obtención de resultados altamente fiables. De manera clave, el conocimiento de dicha información puede ayudar al clínico a la toma de importantes decisiones, que incluyen entre otras actitudes: la indicación (o no) de administrar un antibiótico, el seguimiento del paciente (la aparición de qué síntomas, y durante cuánto tiempo deben ser vigilados), la selección de pruebas serológicas. Por último, la simplicidad del protocolo que ha sido cuidadosamente optimizado durante la presente investigación permite que su implementación sea sumamente asequible para cualquier
laboratorio clínico (con una inversión inicial mínima) que esté dotado de un espectrómetro de masas.
Resumen (otro idioma):
inspección visual del espécimen y las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos.
Sin embargo, ninguno de estos métodos está exento de limitaciones en términos de costes, tiempo de entrega de resultados, laboriosidad, necesidad de personal altamente entrenado, etc.
En los últimos años, la espectrometría de masas por desorción-ionización con láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), ha sido aplicada con éxito en la identificación de garrapatas. Sin embargo, el conocimiento acerca del rendimiento de esta tecnología en un contexto clínico (con pacientes reales) es mucho más limitado. Los objetivos del presente estudio fueron, en primer lugar, la optimización de un protocolo de extracción proteica y adquisición de espectros; en segundo lugar, la construcción de una biblioteca de espectros de referencia, suficientemente representativa. Dicha biblioteca fue construida a partir de los espectros adquiridos a partir de muestras de extremidades de garrapatas. Las
especies de garrapatas que fueron incluidas en la biblioteca incluyen aquellas que suelen picar a humanos en España: Dermacentor marginatus, Dermacentor reticulatus, Haemaphysalis punctata, Hyalomma lusitanicum, Hyalomma marginatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa, Rhipicephalus pusillus y Rhipicephalus sanguineus sensu lato. También se incluyeron aquellas especies que, con menor frecuencia, también están involucradas en picaduras a humanos en nuestro país: Haemaphysalis inermis, Haemaphysalis concinna, Hyalomma scupense, Ixodes
frontalis, Ixodes hexagonus y Argas sp. Los especímenes fueron identificados, primero visualmente, y posteriormente mediante PCR y secuenciación de un fragmento del gen ARNr 16S.
La validación del protocolo se ejecutó mediante la realización secuencial de diversos test. En los primeros de estos ensayos de validación, realizados con especímenes recolectados de diversas fuentes, excepto pacientes, se obtuvo una correlación del 100% entre los métodos moleculares y la espectrometría de masas.
En las segundas de estas pruebas, realizadas exclusivamente con garrapatas retiradas de pacientes, se observó una correlación del 92.59 %, y todas las especies estudiadas obtuvieron unas puntuaciones de identificación discretamente inferiores respecto a los resultados obtenidos en los primeros ensayos. Sólo se obtuvo la identificación incorrecta en el caso de dos ninfas de I. ricinus, las cuales fueron identificadas como Ctenocephalides felis (una especie de pulga). Sin embargo, el problema de discriminación entre estas dos especies difícilmente presente
un impacto clínico apreciable, debido a que ambas especies de artrópodos presentan rasgos morfológicos muy diferenciados.
Tras la validación del protocolo, la tecnología MALDI-TOF MS fue incorporada en el Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa como la técnica
de primera elección en la identificación de garrapatas. Tras quince meses de experiencia clínica, los resultados obtenidos permitieron confirmar el excelente rendimiento observado en los ensayos de validación. Un total de 34 ejemplares fueron remitidos al laboratorio para su identificación, de los cuales 33/34 (97,06 %) obtuvieron una identificación correcta. Tan sólo un ejemplar adulto de R. sanguineus s.l. fue incorrectamente identificado como R. pusillus, ambos con un score de identificación prácticamente idénticos (1,93 vs 1,92).
Por tanto, la tecnología MALDI-TOF MS puede ser utilizada como herramienta de identificación de garrapatas, con la rápida obtención de resultados altamente fiables. De manera clave, el conocimiento de dicha información puede ayudar al clínico a la toma de importantes decisiones, que incluyen entre otras actitudes: la indicación (o no) de administrar un antibiótico, el seguimiento del paciente (la aparición de qué síntomas, y durante cuánto tiempo deben ser vigilados), la selección de pruebas serológicas. Por último, la simplicidad del protocolo que ha sido cuidadosamente optimizado durante la presente investigación permite que su implementación sea sumamente asequible para cualquier
laboratorio clínico (con una inversión inicial mínima) que esté dotado de un espectrómetro de masas.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: enfermedades infecciosas
Titulación: Programa de Doctorado en Medicina
Plan(es): Plan 497
Área de conocimiento: Ciencias de la Salud
Nota: Presentado: 15 12 2023
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2023
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Registro creado el 2024-05-22, última modificación el 2024-05-22
