Pagán Albertos, Elisa
Pagán Tomás, Rafael (dir.) ; García Gonzalo, Diego (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2024
Abstract: La mejora e implementación de los métodos de conservación de los alimentos y de los protocolos de limpieza y desinfección en la industria agroalimentaria precisa del conocimiento detallado de sus mecanismos de inhibición e inactivación microbiana, así como de los mecanismos de resistencia microbiana. Por otro lado, la aparición de cepas bacterianas resistentes en la cadena alimentaria puede comprometer la inocuidad y estabilidad de los alimentos; sin embargo, a su vez, estas variantes resistentes (VR) pueden utilizarse como herramienta de estudio de los mecanismos de resistencia microbiana frente a los métodos de control microbiano más comúnmente empleados. En este sentido, una de las técnicas clave en este ámbito son los experimentos de evolución adaptativa en laboratorio (ALE; adaptive laboratory evolution del inglés). Los estudios realizados hasta ahora por nuestro grupo de investigación han permitido el aislamiento de VR tras ensayos de ALE frente a métodos de conservación de alimentos, como el calor, o antimicrobianos naturales, como los aceites esenciales (AE) o sus principales constituyentes individuales (CI); sin embargo, todos estos ALE se han llevado a cabo obteniendo una única línea de evolución. En esta tesis doctoral hemos continuado esta línea de investigación centrándonos en el estudio de Salmonella spp., por ser el segundo agente zoonótico más problemático en la UE, y en la obtención en paralelo de varias líneas de evolución.
Por tanto, el principal objetivo de esta tesis doctoral ha sido profundizar en los mecanismos de resistencia microbiana de Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium LT2 frente a los métodos de inhibición (carvacrol) e inactivación (calor y agua activada por plasma (PAW; plasma activated water del inglés)) microbiana empleados en la industria alimentaria mediante el aislamiento y la caracterización genotípica y fenotípica de VR. Concretamente se llevaron a cabo tres estudios con distintas líneas de evolución en paralelo con el fin de estudiar la existencia de un patrón común en los cambios genéticos responsables de la adaptación bacteriana. El primero se centró en la obtención de VR tras ALE en presencia de concentraciones subinhibitorias de carvacrol, un compuesto antimicrobiano natural presente en numerosos AE, como el de tomillo; el segundo estudio evaluó la aparición de VR tras tratamientos letales de calor, como tecnología tradicional de conservación de alimentos; mientras que el tercero exploró la aparición de VR tras tratamientos letales con PAW, considerada como una tecnología emergente.
La secuenciación genómica de las VR seleccionadas a través de ALE permitió identificar sus mutaciones, demostrándose que, aunque no suceden en todas las líneas de evolución las mismas mutaciones, sí que existen patrones comunes entre la mayoría de las VR obtenidas mediante diferentes líneas de evolución por cada método de control microbiano ensayado, viéndose afectados genes y rutas metabólicas similares. En este sentido, estas modificaciones genéticas se pueden agrupar en las siguientes categorías: reguladores transcripcionales relacionados con la respuesta celular al estrés oxidativo (rob, yfhP), enzimas relacionadas con las envolturas celulares (wbaV, mreB, mepM), sensores de membrana (cadC, arcB, qseC), proteínas receptoras y de transporte de membrana (cadB, ccmH, nirC, narZ, zntB), proteínas relacionadas con la transcripción (rpoA, rpoD), proteínas relacionadas con la respuesta al calor (lon, dnaJ) o proteínas relacionadas con la motilidad (fliH, flhC, flhA).
Una vez realizada la caracterización genotípica de las VR, se procedió a su caracterización fenotípica, determinando la adquisición de resistencia y tolerancia directa y cruzada frente al método de control microbiano empleado en su selección, como a otros métodos de conservación, biocidas o antibióticos. En comparación con la cepa parental, las VR al carvacrol mostraron incrementos de resistencia directa (RD) del 50 y del 75% y tolerancia cruzada frente al calor y a PAW; las VR a los tratamientos térmicos mostraron una supervivencia frente al calor de hasta 10000 veces mayor; y tolerancia cruzada frente a carvacrol y ácido peracético; y, por último, las VR al PAW mostraron incrementos de tolerancia directa de hasta 255 veces; y algunas de ellas tolerancia cruzada frente a carvacrol, calor, ácido peracético e hipoclorito de sodio. Además, la construcción de nuevas cepas mediante ingeniería genética permitió evaluar el efecto individual de cada mutación sin la interferencia del resto de mutaciones observadas en cada VR. Así, de todas las mutaciones halladas en las VR a carvacrol únicamente las mutaciones en lon y rob estuvieron involucradas en la adquisición de RD, mientras flhA y wbaV, en especial, lo estuvieron en la tolerancia directa, denotando la diferente regulación génica de los fenómenos de adquisición de resistencia y tolerancia. Respecto a la adquisición de tolerancia directa frente al calor, las mutaciones en los genes dnaJ o flhC aumentaron la supervivencia al calor de S. Typhimurium a través de un efecto aditivo de ambas mutaciones. Del mismo modo, el estudio de la tolerancia cruzada permitió evidenciar la consecuencia de las mutaciones identificadas en los genes flagelares sobre la tolerancia al carvacrol y a los tratamientos térmicos. Dichas mutaciones ocasionaron la pérdida de flagelos y consecuentemente de motilidad. No obstante, aunque parece un mecanismo de resistencia recurrente frente a los diferentes métodos evaluados no es único ni generalizado, dado que las VR al PAW mantuvieron su motilidad. Por otra parte, la evaluación de la resistencia cruzada de las VR al carvacrol frente a antibióticos permitió identificar las mutaciones en rob, lon y wbaV como la responsable de los incrementos observados. Finalmente, cabe señalar el elevado número de mutaciones observadas en genes relacionados con las envolturas celulares tanto en genes de enzimas relacionadas con su síntesis (wbaV, mepM) como de proteínas alojadas en ella para realizar su función (qseC o flhA). Estas modificaciones génicas fueron responsables de variaciones en la sensibilidad de las VR a la presencia de sales biliares y cloruro sódico, así como sobre la morfología celular, evaluada mediante microscopía electrónica.
Por otro lado, se evaluó su virulencia en ensayos con Caenorhabditis elegans, con el fin de determinar el impacto de la aparición de las VR en la seguridad alimentaria. Así, se observó que la relación entre adquisición de resistencia y mantenimiento de la virulencia puede ser positiva, como sucede en la VR obtenida en presencia de carvacrol, que causó el mismo nivel de muerte en C. elegans que la cepa parental; o negativa, como sucede en la VR obtenida con PAW, que mejoró la supervivencia de C. elegans con respecto a la cepa parental. Especial atención merece la VR obtenida en presencia de carvacrol que, además de mantener su virulencia, mostró una mejor aptitud para crecer a temperaturas de refrigeración y/o en presencia de concentraciones subletales de carvacrol. En este sentido, cabe señalar que el riesgo de sufrir salmonelosis no sólo se debe definir por el impacto en la virulencia sino también por el grado de resistencia de las VR a los métodos de conservación y su capacidad para crecer bajo diferentes condiciones medioambientales.
Por último, se comprobó la mayor tolerancia de las VR frente al método de inactivación microbiana más comúnmente empleado en la conservación de los alimentos, el calor, en un alimento modelo, el zumo de naranja, y también se detectaron daños subletales en sus envolturas celulares, que podrían ser aprovechados en el diseño de procesos combinados. Aunque los resultados obtenidos son meramente exploratorios, evidencian que la mayor tolerancia de las VR exigiría bien un incremento de la intensidad del tratamiento térmico, o bien un proceso combinado de calor y antimicrobianos, como el citral, que puedan aprovechar los daños subletales de las envolturas celulares para obtener un efecto letal sinérgico, y de este modo, incrementar la inactivación de las VR hasta alcanzar los niveles exigidos.
El desarrollo de esta Tesis Doctoral supone la continuación de la línea de investigación de nuestro grupo que persigue contribuir al conocimiento de las bases fisiológicas responsables de la resistencia y de los mecanismos de respuesta microbiana frente a los métodos de control microbiano utilizados en la industria alimentaria. Esta información es clave para determinar qué método de control microbiano puede ser el más adecuado, y en qué condiciones, en función de la contaminación de la materia prima. El fin último es diseñar estrategias de conservación más eficaces, que nos permitan garantizar la seguridad alimentaria, además de profundizar en las implicaciones que pudiera ocasionar la aparición de VR en el ámbito de la Salud Pública.
Abstract (other lang.):
Por tanto, el principal objetivo de esta tesis doctoral ha sido profundizar en los mecanismos de resistencia microbiana de Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium LT2 frente a los métodos de inhibición (carvacrol) e inactivación (calor y agua activada por plasma (PAW; plasma activated water del inglés)) microbiana empleados en la industria alimentaria mediante el aislamiento y la caracterización genotípica y fenotípica de VR. Concretamente se llevaron a cabo tres estudios con distintas líneas de evolución en paralelo con el fin de estudiar la existencia de un patrón común en los cambios genéticos responsables de la adaptación bacteriana. El primero se centró en la obtención de VR tras ALE en presencia de concentraciones subinhibitorias de carvacrol, un compuesto antimicrobiano natural presente en numerosos AE, como el de tomillo; el segundo estudio evaluó la aparición de VR tras tratamientos letales de calor, como tecnología tradicional de conservación de alimentos; mientras que el tercero exploró la aparición de VR tras tratamientos letales con PAW, considerada como una tecnología emergente.
La secuenciación genómica de las VR seleccionadas a través de ALE permitió identificar sus mutaciones, demostrándose que, aunque no suceden en todas las líneas de evolución las mismas mutaciones, sí que existen patrones comunes entre la mayoría de las VR obtenidas mediante diferentes líneas de evolución por cada método de control microbiano ensayado, viéndose afectados genes y rutas metabólicas similares. En este sentido, estas modificaciones genéticas se pueden agrupar en las siguientes categorías: reguladores transcripcionales relacionados con la respuesta celular al estrés oxidativo (rob, yfhP), enzimas relacionadas con las envolturas celulares (wbaV, mreB, mepM), sensores de membrana (cadC, arcB, qseC), proteínas receptoras y de transporte de membrana (cadB, ccmH, nirC, narZ, zntB), proteínas relacionadas con la transcripción (rpoA, rpoD), proteínas relacionadas con la respuesta al calor (lon, dnaJ) o proteínas relacionadas con la motilidad (fliH, flhC, flhA).
Una vez realizada la caracterización genotípica de las VR, se procedió a su caracterización fenotípica, determinando la adquisición de resistencia y tolerancia directa y cruzada frente al método de control microbiano empleado en su selección, como a otros métodos de conservación, biocidas o antibióticos. En comparación con la cepa parental, las VR al carvacrol mostraron incrementos de resistencia directa (RD) del 50 y del 75% y tolerancia cruzada frente al calor y a PAW; las VR a los tratamientos térmicos mostraron una supervivencia frente al calor de hasta 10000 veces mayor; y tolerancia cruzada frente a carvacrol y ácido peracético; y, por último, las VR al PAW mostraron incrementos de tolerancia directa de hasta 255 veces; y algunas de ellas tolerancia cruzada frente a carvacrol, calor, ácido peracético e hipoclorito de sodio. Además, la construcción de nuevas cepas mediante ingeniería genética permitió evaluar el efecto individual de cada mutación sin la interferencia del resto de mutaciones observadas en cada VR. Así, de todas las mutaciones halladas en las VR a carvacrol únicamente las mutaciones en lon y rob estuvieron involucradas en la adquisición de RD, mientras flhA y wbaV, en especial, lo estuvieron en la tolerancia directa, denotando la diferente regulación génica de los fenómenos de adquisición de resistencia y tolerancia. Respecto a la adquisición de tolerancia directa frente al calor, las mutaciones en los genes dnaJ o flhC aumentaron la supervivencia al calor de S. Typhimurium a través de un efecto aditivo de ambas mutaciones. Del mismo modo, el estudio de la tolerancia cruzada permitió evidenciar la consecuencia de las mutaciones identificadas en los genes flagelares sobre la tolerancia al carvacrol y a los tratamientos térmicos. Dichas mutaciones ocasionaron la pérdida de flagelos y consecuentemente de motilidad. No obstante, aunque parece un mecanismo de resistencia recurrente frente a los diferentes métodos evaluados no es único ni generalizado, dado que las VR al PAW mantuvieron su motilidad. Por otra parte, la evaluación de la resistencia cruzada de las VR al carvacrol frente a antibióticos permitió identificar las mutaciones en rob, lon y wbaV como la responsable de los incrementos observados. Finalmente, cabe señalar el elevado número de mutaciones observadas en genes relacionados con las envolturas celulares tanto en genes de enzimas relacionadas con su síntesis (wbaV, mepM) como de proteínas alojadas en ella para realizar su función (qseC o flhA). Estas modificaciones génicas fueron responsables de variaciones en la sensibilidad de las VR a la presencia de sales biliares y cloruro sódico, así como sobre la morfología celular, evaluada mediante microscopía electrónica.
Por otro lado, se evaluó su virulencia en ensayos con Caenorhabditis elegans, con el fin de determinar el impacto de la aparición de las VR en la seguridad alimentaria. Así, se observó que la relación entre adquisición de resistencia y mantenimiento de la virulencia puede ser positiva, como sucede en la VR obtenida en presencia de carvacrol, que causó el mismo nivel de muerte en C. elegans que la cepa parental; o negativa, como sucede en la VR obtenida con PAW, que mejoró la supervivencia de C. elegans con respecto a la cepa parental. Especial atención merece la VR obtenida en presencia de carvacrol que, además de mantener su virulencia, mostró una mejor aptitud para crecer a temperaturas de refrigeración y/o en presencia de concentraciones subletales de carvacrol. En este sentido, cabe señalar que el riesgo de sufrir salmonelosis no sólo se debe definir por el impacto en la virulencia sino también por el grado de resistencia de las VR a los métodos de conservación y su capacidad para crecer bajo diferentes condiciones medioambientales.
Por último, se comprobó la mayor tolerancia de las VR frente al método de inactivación microbiana más comúnmente empleado en la conservación de los alimentos, el calor, en un alimento modelo, el zumo de naranja, y también se detectaron daños subletales en sus envolturas celulares, que podrían ser aprovechados en el diseño de procesos combinados. Aunque los resultados obtenidos son meramente exploratorios, evidencian que la mayor tolerancia de las VR exigiría bien un incremento de la intensidad del tratamiento térmico, o bien un proceso combinado de calor y antimicrobianos, como el citral, que puedan aprovechar los daños subletales de las envolturas celulares para obtener un efecto letal sinérgico, y de este modo, incrementar la inactivación de las VR hasta alcanzar los niveles exigidos.
El desarrollo de esta Tesis Doctoral supone la continuación de la línea de investigación de nuestro grupo que persigue contribuir al conocimiento de las bases fisiológicas responsables de la resistencia y de los mecanismos de respuesta microbiana frente a los métodos de control microbiano utilizados en la industria alimentaria. Esta información es clave para determinar qué método de control microbiano puede ser el más adecuado, y en qué condiciones, en función de la contaminación de la materia prima. El fin último es diseñar estrategias de conservación más eficaces, que nos permitan garantizar la seguridad alimentaria, además de profundizar en las implicaciones que pudiera ocasionar la aparición de VR en el ámbito de la Salud Pública.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: biología molecular de microorganismos ; microbiología de alimentos ; conservación de alimentos ; ingeniería genética
Titulación: Programa de Doctorado en Calidad, Seguridad y Tecnología de los Alimentos
Plan(es): Plan 486
Knowledge area: Ciencias
Nota: Presentado: 23 07 2024
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2024
Contribution of the TFG/M to Sustainability: Garantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades. Garantizar las pautas de consumo y de producción sostenibles.
Fecha de embargo : 2026-07-23
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Record created 2024-10-03, last modified 2024-10-03
