Freire Carrascosa, Víctor
Condón Usón, Santiago (dir.) ; Gayán Ordás, Elisa (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2024
Abstract: Las bacterias formadoras de esporos son causa importante del deterioro de alimentos, y ciertas cepas de Bacillus spp. y Clostridium spp. pueden causar graves toxiinfecciones alimentarias. El control de los esporos bacterianos es uno de los principales desafíos para la industria
alimentaria debido a su amplia distribución y su extrema resistencia a la mayoría de los métodos de conservación.
La esterilización térmica es el método de conservación de alimentos más utilizado para lograr niveles adecuados de inactivación de estos microorganismos. En los alimentos que son procesados con tratamientos más suaves, los esporos supervivientes son controlados por una combinación de barreras, como la refrigeración, la acidificación y la baja actividad de agua (aw), que inhiben o retrasan la germinación y/o el crecimiento.
Sin embargo, la gran variabilidad en la resistencia al calor y la germinación de los esporos que contaminan los alimentos dificulta establecer condiciones generales de conservación. Esta heterogeneidad resulta no solo de diferencias inherentes entre especies y cepas, sino también de diferencias en las condiciones de esporulación, que generalmente se desconocen para los esporos que se encuentran en los alimentos.
Varios estudios han abordado el efecto de estas condiciones ambientales de esporulación, en particular la temperatura, sobre las propiedades de los esporos. Sin embargo, existen pocos datos sobre otros factores relevantes, como aw, y es difícil comparar e identificar las condiciones más influyentes entre diferentes estudios debido a las diferencias en las condiciones experimentales utilizadas.
El objetivo de esta tesis doctoral fue investigar el efecto de condiciones ambientales adversas de esporulación con una intensidad que generen un nivel similar de estrés en términos de reducción en la eficiencia de esporulación, sobre la resistencia y las propiedades de germinación de los esporos resultantes. Esto permitió realizar comparaciones significativas entre diferentes condiciones.
Para ello, se utilizó B. subtilis 168 como organismo modelo. Primero establecimos condiciones de esporulación que resultaron en una eficiencia de esporulación reducida entre el 50% y el 70% en comparación con las condiciones óptimas de esporulación (37 ºC, pH 7,0, aw > 0,99, dando lugar a la población de referencia: Scontrol): 20 ºC, pH 5,0, aw 0,98 mediante la adición de NaCl o glicerol, lo que dio lugar a las poblaciones
de esporos; S20ºC, S43ºC, Ssalt y Sgly, respectivamente.
La caracterización de las cinéticas de inactivación térmica de todas las poblaciones de esporos preparadas bajo condiciones adversas y control reveló que el factor más influyente en la resistencia al calor y su termodependencia fue la reducción de la temperatura de esporulación, de modo que los esporos S20ºC mostraron los valores DT y z más bajos. Los esporos más resistentes al calor fueron aquellos formados a aw reducida, aunque la magnitud del efecto dependía de la temperatura del tratamiento y del soluto. Los esporos Ssalt mostraron el mayor
aumento en la resistencia al calor en el rango de temperaturas probadas, probablemente debido a un menor ritmo de acumulación de daño.
En general, la variabilidad en la resistencia al calor (calculada a partir de los valores de 4D100 ºC) entre los fenotipos más extremos inducidos por variaciones en las condiciones de esporulación (esporos S20ºC frente a esporos Ssalt) alcanzó un cambio de 11,1 veces, mayor que el anteriormente observado por otros autores para variaciones intraespecíficas. Todos los esporos obtenidos bajo condiciones adversas de esporulación, incluidas las poblaciones más resistentes al calor producidas a aw reducida, mostraron menor resistencia al hipoclorito de sodio y a la radiación UV-C que aquellos producidos en un entorno óptimo, lo que sugiere que podrían emplearse como estrategias alternativas y efectivas de control para estas poblaciones. Por el contrario, los esporos S20ºC fueron más resistentes a la radiación UV-C.
La germinación también se vio afectada en gran medida por la temperatura de esporulación y aw, aunque la magnitud del cambio en el ritmo de germinación y/o la eficiencia era variable con el tipo de germinante y, en el caso de la esporulación a aw reducida, del soluto utilizado. Los esporos producidos a 43 ºC generalmente mostraron una mejora significativa en el ritmo y/o la eficiencia de germinación, especialmente en respuesta a AGFK, en comparación con los esporos control, mientras que aquellos producidos a 20 ºC exhibieron una germinación deficiente. Además, la respuesta de los esporos S43ºC a los nutrientes fue menos afectada por condiciones adversas de germinación en temperatura, pH y aw, y mostró umbrales más bajos de temperatura y pH y aw (reducida empleando NaCl) para la inhibición de la germinación que los esporos producidos a temperaturas más bajas.
Los esporos producidos bajo condiciones de baja aw mostraron una germinación deficiente en la mayoría de los nutrientes probados.
Como tendencia general, aunque con variaciones según el nutriente utilizado, la temperatura de esporulación fue el factor más influyente en el ritmo de germinación de los esporos no activados por calor, mientras que tanto la temperatura de esporulación como la reducción de aw fueron igualmente influyentes en la eficiencia de la germinación. Es importante destacar que la activación térmica (65 ºC, 30 min) de los esporos antes de la exposición a nutrientes disminuyó las diferencias inducidas por los cambios en la temperatura de esporulación, principalmente porque la respuesta de los esporos S20ºC mejoró notablemente en comparación con la de los esporos S43ºC, pero no pudo atenuar la germinación deficiente de ambas poblaciones producidas a aw reducida. Así, la reducción de aw fue el factor de esporulación más influyente en la
germinación por nutrientes de los esporos activados por calor.
Aunque las tres poblaciones de esporos S20ºC, Ssalt y Sgly mostraron menor aptitud de germinación en nutrientes y un ritmo de germinación más alto en dodecilamina que los esporos Scontrol, los esporos S20ºC mostraron una germinación mejorada en Ca-DPA, mientras que los
esporos Ssalt y Sgly mostraron una respuesta deficiente. Estos resultados, junto con el diferente grado de supresión de la germinación en cada nutriente entre las poblaciones de esporos y el diferente efecto de la activación térmica, sugieren que la reducción de la temperatura de esporulación o aw con cada soluto altera la germinación por diferentes mecanismos. El fenotipo de los esporos Ssalt, junto con los análisis fisicoquímicos y de imagen, indicaron que los cambios en la capa externa pueden contribuir al comportamiento diferente de estos esporos en comparación con los producidos en condiciones óptimas.
Utilizando esporos mutantes defectuosos en la morfogénesis de diferentes capas de la envoltura, se demostró que el crust juega un papel importante en el aumento de la resistencia al calor y que tanto el crust como el coat externo, son críticos para el deterioro de la germinación en nutrientes de los esporos Ssalt.
El estudio del efecto de las condiciones ambientales de esporulación más influyentes en el comportamiento de los esporos de B. subtilis, temperatura y aw, se extendió a varias cepas de B. weihenstephanensis, que representan una preocupación significativa para la estabilidad y
seguridad en productos refrigerados y de vida útil extendida (ESL). Aunque la esporulación a alta concentración de NaCl no alteró la resistencia al calor ni la germinación de los esporos de B. weihenstephanensis, la esporulación a la temperatura mínima y máxima que permitió la esporulación sí afectó su comportamiento.
El efecto de la temperatura de esporulación en la germinación de los esporos de B. weihenstephanensis en aminoácidos, inosina y sus combinaciones dependió del tipo de cepa, del nutriente y de la aplicación de un tratamiento de activación térmica, pero algunas tendencias generales coincidieron con las observadas para los esporos de B. subtilis: i) los esporos no activados de B. weihenstephanensis producidos a la
temperatura máxima de esporulación generalmente germinaron mejor que aquellos producidos a la temperatura óptima; ii) la activación térmica (80 ºC, 10 min) redujo las diferencias en la germinación inducidas por la temperatura de esporulación, excepto en algunas cepas, pero los esporos producidos a la temperatura mínima representaron las poblaciones con peor respuesta; iii) el grado de deterioro de la germinación causado por la reducción de la temperatura de incubación desde el valor óptimo de crecimiento en una matriz rica en nutrientes fue menor en
los esporos producidos a la temperatura máxima que a la mínima de esporulación. Cabe señalar que el efecto de la temperatura de esporulación en la germinación de los esporos de B. weihenstephanensis observado en medios de laboratorio con nutrientes específicos durante un breve período de tiempo no puede extrapolarse al comportamiento de los esporos en matrices alimentarias bajo condiciones industriales de almacenamiento.
Utilizando un modelo de matriz ESL, demostramos que el tratamiento de pasteurización recomendado para productos ESL (90 ºC, 10 min) aumenta el ritmo de germinación de los esporos supervivientes de B. weihenstephanensis, a pesar de matar a una gran proporción de la
población, en mayor medida que un tratamiento subletal (80 ºC, 10 min). Además, algunas cepas, sin necesariamente producir los esporos más resistentes, pudieron reparar el daño y reanudar el crecimiento tras el tratamiento a 8 ºC y envasado al vacío, pero no a 4 ºC. Así, además de la variabilidad intraespecífica en la resistencia al calor, la capacidad de los esporos tratados térmicamente para restaurar la viabilidad y el crecimiento bajo condiciones industriales debe considerarse al establecer condiciones adecuadas de procesamiento térmico,
mientras que se recomienda una temperatura de almacenamiento inferior a 8 ºC para productos sometidos a este tratamiento.
En conclusión, esta investigación destaca el papel importante de las condiciones ambientales de esporulación en la modulación de la resistencia y germinación de los esporos de B. subtilis y B. weihenstephanensis, especialmente la temperatura de esporulación y aw, factores que pueden volverse más relevantes en vista del calentamiento global y la salinización del suelo.
Se necesita más investigación sobre los efectos de estas condiciones ambientales de esporulación en las propiedades de otras bacterias esporuladas relevantes para la seguridad y estabilidad alimentaria.
Abstract (other lang.):
alimentaria debido a su amplia distribución y su extrema resistencia a la mayoría de los métodos de conservación.
La esterilización térmica es el método de conservación de alimentos más utilizado para lograr niveles adecuados de inactivación de estos microorganismos. En los alimentos que son procesados con tratamientos más suaves, los esporos supervivientes son controlados por una combinación de barreras, como la refrigeración, la acidificación y la baja actividad de agua (aw), que inhiben o retrasan la germinación y/o el crecimiento.
Sin embargo, la gran variabilidad en la resistencia al calor y la germinación de los esporos que contaminan los alimentos dificulta establecer condiciones generales de conservación. Esta heterogeneidad resulta no solo de diferencias inherentes entre especies y cepas, sino también de diferencias en las condiciones de esporulación, que generalmente se desconocen para los esporos que se encuentran en los alimentos.
Varios estudios han abordado el efecto de estas condiciones ambientales de esporulación, en particular la temperatura, sobre las propiedades de los esporos. Sin embargo, existen pocos datos sobre otros factores relevantes, como aw, y es difícil comparar e identificar las condiciones más influyentes entre diferentes estudios debido a las diferencias en las condiciones experimentales utilizadas.
El objetivo de esta tesis doctoral fue investigar el efecto de condiciones ambientales adversas de esporulación con una intensidad que generen un nivel similar de estrés en términos de reducción en la eficiencia de esporulación, sobre la resistencia y las propiedades de germinación de los esporos resultantes. Esto permitió realizar comparaciones significativas entre diferentes condiciones.
Para ello, se utilizó B. subtilis 168 como organismo modelo. Primero establecimos condiciones de esporulación que resultaron en una eficiencia de esporulación reducida entre el 50% y el 70% en comparación con las condiciones óptimas de esporulación (37 ºC, pH 7,0, aw > 0,99, dando lugar a la población de referencia: Scontrol): 20 ºC, pH 5,0, aw 0,98 mediante la adición de NaCl o glicerol, lo que dio lugar a las poblaciones
de esporos; S20ºC, S43ºC, Ssalt y Sgly, respectivamente.
La caracterización de las cinéticas de inactivación térmica de todas las poblaciones de esporos preparadas bajo condiciones adversas y control reveló que el factor más influyente en la resistencia al calor y su termodependencia fue la reducción de la temperatura de esporulación, de modo que los esporos S20ºC mostraron los valores DT y z más bajos. Los esporos más resistentes al calor fueron aquellos formados a aw reducida, aunque la magnitud del efecto dependía de la temperatura del tratamiento y del soluto. Los esporos Ssalt mostraron el mayor
aumento en la resistencia al calor en el rango de temperaturas probadas, probablemente debido a un menor ritmo de acumulación de daño.
En general, la variabilidad en la resistencia al calor (calculada a partir de los valores de 4D100 ºC) entre los fenotipos más extremos inducidos por variaciones en las condiciones de esporulación (esporos S20ºC frente a esporos Ssalt) alcanzó un cambio de 11,1 veces, mayor que el anteriormente observado por otros autores para variaciones intraespecíficas. Todos los esporos obtenidos bajo condiciones adversas de esporulación, incluidas las poblaciones más resistentes al calor producidas a aw reducida, mostraron menor resistencia al hipoclorito de sodio y a la radiación UV-C que aquellos producidos en un entorno óptimo, lo que sugiere que podrían emplearse como estrategias alternativas y efectivas de control para estas poblaciones. Por el contrario, los esporos S20ºC fueron más resistentes a la radiación UV-C.
La germinación también se vio afectada en gran medida por la temperatura de esporulación y aw, aunque la magnitud del cambio en el ritmo de germinación y/o la eficiencia era variable con el tipo de germinante y, en el caso de la esporulación a aw reducida, del soluto utilizado. Los esporos producidos a 43 ºC generalmente mostraron una mejora significativa en el ritmo y/o la eficiencia de germinación, especialmente en respuesta a AGFK, en comparación con los esporos control, mientras que aquellos producidos a 20 ºC exhibieron una germinación deficiente. Además, la respuesta de los esporos S43ºC a los nutrientes fue menos afectada por condiciones adversas de germinación en temperatura, pH y aw, y mostró umbrales más bajos de temperatura y pH y aw (reducida empleando NaCl) para la inhibición de la germinación que los esporos producidos a temperaturas más bajas.
Los esporos producidos bajo condiciones de baja aw mostraron una germinación deficiente en la mayoría de los nutrientes probados.
Como tendencia general, aunque con variaciones según el nutriente utilizado, la temperatura de esporulación fue el factor más influyente en el ritmo de germinación de los esporos no activados por calor, mientras que tanto la temperatura de esporulación como la reducción de aw fueron igualmente influyentes en la eficiencia de la germinación. Es importante destacar que la activación térmica (65 ºC, 30 min) de los esporos antes de la exposición a nutrientes disminuyó las diferencias inducidas por los cambios en la temperatura de esporulación, principalmente porque la respuesta de los esporos S20ºC mejoró notablemente en comparación con la de los esporos S43ºC, pero no pudo atenuar la germinación deficiente de ambas poblaciones producidas a aw reducida. Así, la reducción de aw fue el factor de esporulación más influyente en la
germinación por nutrientes de los esporos activados por calor.
Aunque las tres poblaciones de esporos S20ºC, Ssalt y Sgly mostraron menor aptitud de germinación en nutrientes y un ritmo de germinación más alto en dodecilamina que los esporos Scontrol, los esporos S20ºC mostraron una germinación mejorada en Ca-DPA, mientras que los
esporos Ssalt y Sgly mostraron una respuesta deficiente. Estos resultados, junto con el diferente grado de supresión de la germinación en cada nutriente entre las poblaciones de esporos y el diferente efecto de la activación térmica, sugieren que la reducción de la temperatura de esporulación o aw con cada soluto altera la germinación por diferentes mecanismos. El fenotipo de los esporos Ssalt, junto con los análisis fisicoquímicos y de imagen, indicaron que los cambios en la capa externa pueden contribuir al comportamiento diferente de estos esporos en comparación con los producidos en condiciones óptimas.
Utilizando esporos mutantes defectuosos en la morfogénesis de diferentes capas de la envoltura, se demostró que el crust juega un papel importante en el aumento de la resistencia al calor y que tanto el crust como el coat externo, son críticos para el deterioro de la germinación en nutrientes de los esporos Ssalt.
El estudio del efecto de las condiciones ambientales de esporulación más influyentes en el comportamiento de los esporos de B. subtilis, temperatura y aw, se extendió a varias cepas de B. weihenstephanensis, que representan una preocupación significativa para la estabilidad y
seguridad en productos refrigerados y de vida útil extendida (ESL). Aunque la esporulación a alta concentración de NaCl no alteró la resistencia al calor ni la germinación de los esporos de B. weihenstephanensis, la esporulación a la temperatura mínima y máxima que permitió la esporulación sí afectó su comportamiento.
El efecto de la temperatura de esporulación en la germinación de los esporos de B. weihenstephanensis en aminoácidos, inosina y sus combinaciones dependió del tipo de cepa, del nutriente y de la aplicación de un tratamiento de activación térmica, pero algunas tendencias generales coincidieron con las observadas para los esporos de B. subtilis: i) los esporos no activados de B. weihenstephanensis producidos a la
temperatura máxima de esporulación generalmente germinaron mejor que aquellos producidos a la temperatura óptima; ii) la activación térmica (80 ºC, 10 min) redujo las diferencias en la germinación inducidas por la temperatura de esporulación, excepto en algunas cepas, pero los esporos producidos a la temperatura mínima representaron las poblaciones con peor respuesta; iii) el grado de deterioro de la germinación causado por la reducción de la temperatura de incubación desde el valor óptimo de crecimiento en una matriz rica en nutrientes fue menor en
los esporos producidos a la temperatura máxima que a la mínima de esporulación. Cabe señalar que el efecto de la temperatura de esporulación en la germinación de los esporos de B. weihenstephanensis observado en medios de laboratorio con nutrientes específicos durante un breve período de tiempo no puede extrapolarse al comportamiento de los esporos en matrices alimentarias bajo condiciones industriales de almacenamiento.
Utilizando un modelo de matriz ESL, demostramos que el tratamiento de pasteurización recomendado para productos ESL (90 ºC, 10 min) aumenta el ritmo de germinación de los esporos supervivientes de B. weihenstephanensis, a pesar de matar a una gran proporción de la
población, en mayor medida que un tratamiento subletal (80 ºC, 10 min). Además, algunas cepas, sin necesariamente producir los esporos más resistentes, pudieron reparar el daño y reanudar el crecimiento tras el tratamiento a 8 ºC y envasado al vacío, pero no a 4 ºC. Así, además de la variabilidad intraespecífica en la resistencia al calor, la capacidad de los esporos tratados térmicamente para restaurar la viabilidad y el crecimiento bajo condiciones industriales debe considerarse al establecer condiciones adecuadas de procesamiento térmico,
mientras que se recomienda una temperatura de almacenamiento inferior a 8 ºC para productos sometidos a este tratamiento.
En conclusión, esta investigación destaca el papel importante de las condiciones ambientales de esporulación en la modulación de la resistencia y germinación de los esporos de B. subtilis y B. weihenstephanensis, especialmente la temperatura de esporulación y aw, factores que pueden volverse más relevantes en vista del calentamiento global y la salinización del suelo.
Se necesita más investigación sobre los efectos de estas condiciones ambientales de esporulación en las propiedades de otras bacterias esporuladas relevantes para la seguridad y estabilidad alimentaria.
Abstract (other lang.):
Pal. clave: tecnología de los alimentos ; agentes patógenos de los alimentos ; conservación de alimentos ; microbiología de alimentos
Titulación: Programa de Doctorado en Calidad, Seguridad y Tecnología de los Alimentos
Plan(es): Plan 486
Knowledge area: Ciencias
Nota: Presentado: 29 11 2024
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2024
Contribution of the TFG/M to Sustainability: Poner fin al hambre, conseguir la seguridad alimentaria y una mejor nutrición, y promover la agricultura sostenible. Garantizar una vida saludable y promover el bienestar para todos y todas en todas las edades. Garantizar las pautas de consumo y de producción sostenibles.
Fecha de embargo : 2026-11-29
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Record created 2025-03-14, last modified 2025-03-14
