| TAZ-TFM-2015-741 |
Análisis transcriptomico como herramienta de estudio del mecanismo de inactivación bacteriana de citral y carvacrol.
Pérez Sáez, Elisa
García Gonzalo, Diego (dir.) ; Pagán Tomás, Rafael (dir.)
Universidad de Zaragoza,
VET,
2015
Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos, Área de Tecnología de Alimentos
Máster Universitario en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Resumen: La tendencia creciente de evitar el uso de conservantes alimentarios sintéticos está promoviendo la búsqueda de sustitutos de origen natural, como los constituyentes de aceites esenciales (AEs) carvacrol y citral. El uso efectivo del citral y del carvacrol para la conservación de los alimentos requiere un extenso conocimiento sobre sus mecanismos de inactivación microbiana, así como los mecanismos de resistencia y adaptación bacteriana frente a estos compuestos. El uso conjunto de las herramientas moleculares junto con las técnicas tradicionales de microbiología nos ofrece una excelente oportunidad para estudiar estos mecanismos de forma detallada. El objetivo de este estudio fue la identificación de los genes implicados en la respuesta de Escherichia coli al citral y carvacrol mediante el análisis del transcriptoma, para así determinar los genes que se sobre-expresan tras el tratamiento y conocer el mecanismo de respuesta celular a estos compuestos. Además, se estudió la implicación de los genes sobre-expresados en la resistencia al tratamiento con el antimicrobiano mediante el uso de cepas mutantes deletéreas en los genes de interés. En cuanto a las herramientas moleculares, los microarrays de DNA fueron utilizados para el estudio del mecanismo de inactivación bacteriana por los constituyentes de AEs, y los datos obtenidos fueron confirmados mediante PCR cuantitativa retrotranscriptasa (RT qPCR). Los resultados obtenidos por microarrays de DNA mostraron que las células tratadas con carvacrol activaron la expresión de un mayor número de genes (61 genes sobre-expresados) que las células tratadas con citral (27 genes sobre-expresados). Mediante RT qPCR se verificó la en las células tratadas con citral de 10 genes (purH, pyrB, pyrI, sdhA, yaaX, ybiJ, ybjM, yejF, yejG e yneI), que indicarían que la célula responde al estrés generado mediante la generación de energía y el metabolismo celular, activando los mecanismos de detoxificación e induciendo su eliminación hacia el exterior celular. En el caso de las células tratadas con carvacrol, la técnica de RT qPCR mostró que la de 9 genes (acrA, argG, artJ, cvpA, inaA, pspB, pspC, pspG y znuC) sugeriría que la célula responde al estrés mediante la síntesis de canales iónicos o bombas de expulsión. Además, el carvacrol parece descompensar el equilibrio extracitoplasmático, frente al que la célula respondería con proteínas relacionadas con su protección ante la infección de fagos (proteínas Psp) o colicina V para inhibir el crecimiento de otras bacterias. La evaluación de la resistencia de mutantes deletéreos en los genes sobre-expresados sugirió que ninguno de estos genes estudiados están implicados por sí solos en la resistencia al citral, si no que sería necesaria una acción conjunta de varios de estos genes para realizar una respuesta adecuada frente a este compuesto antimicrobiano. Para la consecución de este estudio fue necesaria la puesta a punto de la metodología necesaria para la evaluación de la expresión génica de Escherichia coli mediante RT qPCR. Además, el desarrollo de esta investigación ha requerido del uso conjunto de varias técnicas de microbiología, tanto moleculares como tradicionales. De este modo, a través de los microarrays de DNA se pudo obtener una visión global de la respuesta celular, señalando diferentes genes candidatos que fueron validados por RT qPCR. A partir de estos resultados, se evaluó la resistencia celular al citral mediante técnicas de microbiología tradicional, como es la siembra en diferentes medios de recuperación. Esta investigación demuestra la importancia e interés del uso conjunto de diferentes técnicas microbiológicas para evaluar el mecanismo de inactivación microbiana por compuestos de aceites esenciales, y ayudar a diseñar procesos de conservación de los alimentos más eficientes y efectivos.
Tipo de Trabajo Académico: Trabajo Fin de Master
Notas: Resumen disponible también en inglés.
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